魚類MHC及其基因的研究進(jìn)展

耿昕穎，王家禎，王巍，單曉楓，馬紅霞，高云航(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118)

主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompitibility complex，MHC)是存在于脊椎動(dòng)物的高度多態(tài)性基因組成的染色體結(jié)構(gòu)，其編碼蛋白樣受體廣泛參與特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，對(duì)機(jī)體的免疫具有極為重要的意義。MHC最初是Gorer等在研究小鼠腫瘤細(xì)胞的排斥反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，從而引進(jìn)的主要組織相容性復(fù)合體的概念。隨后又在其他物種中相繼發(fā)現(xiàn)MHC，人們發(fā)現(xiàn)該基因普遍存在于各種脊椎動(dòng)物中［1］，MHC基因更是受到了極大的重視。1990年，Hashimoto等首次在鯉魚(Cyprinus carpio)中發(fā)現(xiàn)了MHC基因，現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)幾十種魚類的MHC進(jìn)行了研究，如鯉魚［2］、真鯛［3］等。目前我國(guó)也對(duì)多種魚類MHC基因進(jìn)行了研究，如牙鲆［4］、草魚［5］和紫紅笛鯛［6］等?；诖?，筆者對(duì)魚類 MHC 及基因的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為提高魚類抗病性的育種選擇提供理論基礎(chǔ)和重要依據(jù)。

1 MHC分子的分類和結(jié)構(gòu)

1.1 MHCⅠ類分子的結(jié)構(gòu) MHCⅠ類分子是一種糖蛋白，由α鏈和β2微球蛋白以非共價(jià)鍵形成的異源二聚體，均屬于Ig超家族的成員。α鏈又稱重鏈，分為α1、α2和α3胞外區(qū)、1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)胞質(zhì)區(qū)，每個(gè)功能區(qū)約含90個(gè)氨基酸殘基，α1區(qū)和α2區(qū)的氨基酸順序變化較大決定著Ⅰ類分子的多態(tài)性，魚類的MHC I類分子分成經(jīng)典的MHC Ia和非經(jīng)典的MHC Ib兩類。MHC Ia分子的α2、α3結(jié)構(gòu)域中含有保守的多肽結(jié)合區(qū)、4個(gè)保守的半胱氨酸殘基、CD8作用位點(diǎn)及β2-m結(jié)合位點(diǎn)等，在肺魚和鯉魚中還有N-糖基化位點(diǎn)。目前，研究發(fā)現(xiàn)已在鯉魚、鯊魚、虹鱒、斑馬魚中克隆到編碼MHC Ia及MHC Ib分子的基因，MHC Ib分子多態(tài)現(xiàn)象明顯，其功能與MHC Ia也有明顯區(qū)別。

1.2 MHCⅡ類分子的結(jié)構(gòu) MHCⅡ類分子只存在于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞表面以及胸腺上，所有的Ⅱ類分子是由α鏈和β鏈非共價(jià)結(jié)合的異二聚體，2條鏈的總體結(jié)構(gòu)相似［7］，α鏈略重于β鏈，2條多肽鏈均為膜結(jié)合蛋白，跨越細(xì)胞膜伸入細(xì)胞內(nèi)。魚類的MHCⅡ類分子同樣也是由2條α鏈(分子量約為32～34 kD)和2條β鏈(分子量約為26～29 kD)組成的異二聚體，分別由MHCⅡA基因和MHCⅡB基因編碼。肽鏈分子量的大小及差異可能與所含糖基的不同有關(guān)，α鏈含有2個(gè)N-連接寡糖，β鏈含有1個(gè)N-連接寡糖。2條多肽鏈各由4個(gè)功能區(qū)組成，即2個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域(α1和 α2、β1和 β2)、1個(gè)含個(gè)氨基酸的30跨膜區(qū)和1個(gè)10～15個(gè)氨基酸的胞質(zhì)區(qū)，結(jié)構(gòu)上具有保守的多肽結(jié)合區(qū)、半胱氨酸殘基及N-糖基化位點(diǎn)等。

1.3 MHCⅢ類分子的結(jié)構(gòu) MHCⅢ類分子由MHC區(qū)域內(nèi)的另外一些基因編碼，這些蛋白的功能相差較大。MHCⅢ類分子基因編碼補(bǔ)體成分C1、C2、C3和 C4［8-9］，其他基因座分別編碼21-羥化酶A和B、腫瘤壞死因子(TNF-α和TNF-β)和熱休克蛋白70(Hsp 70)。MHCⅢ類分子不同于Ⅰ、Ⅱ類分子，它們不是膜結(jié)合蛋白，沒有抗原呈遞作用。

2 MHC的功能

2.1 MHC的免疫功能 MHC主要存在于特異性免疫抗原呈遞細(xì)胞中，與機(jī)體免疫密切相關(guān)［10］，其功能是作為抗原呈遞分子參與特異性免疫應(yīng)答，并調(diào)節(jié)分子參與固有免疫應(yīng)答［11］，調(diào)控免疫應(yīng)答，在特異性免疫應(yīng)答中起到重要作用，且具有許多與免疫有關(guān)的基因位點(diǎn)。MHC基因主要負(fù)責(zé)抗原呈遞，Ⅰ類基因主要結(jié)合細(xì)胞內(nèi)抗原，與來自胞內(nèi)多肽結(jié)合槽結(jié)合成肽段，可結(jié)合β2-微球蛋白，形成穩(wěn)定的MHCⅠ類-肽分子結(jié)合體，并把多肽呈遞給CD+8T細(xì)胞，使T細(xì)胞活化進(jìn)行細(xì)胞免疫。Ⅱ類基因主要負(fù)責(zé)外源性抗原的加工和呈遞，它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由α、β和γ鏈組成完整三聚體，γ鏈被蛋白酶水解后，抗原性多肽與MHCⅡ分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的MHCⅡ-抗原多肽復(fù)合物，運(yùn)至細(xì)胞表面，在溶酶體中或線粒體中外源性抗原與MHCⅡ類分子結(jié)合后呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

2.2 MHC組織排異功能 MHC有組織性排異功能。這種排斥作用主要是由于供受體之間不同MHC分子個(gè)體之間的存在差異所引起的，表達(dá)相同的MHC分子的個(gè)體可以接受彼此的移植物，而表達(dá)不同的個(gè)體卻有排異作用。最初在魚類中發(fā)現(xiàn)MHC存在也是根據(jù)魚類組織移植有排異現(xiàn)象而斷定的，自Van等［12］發(fā)現(xiàn)鯉魚中存在與高等動(dòng)物MHC類似的免疫排斥反應(yīng)體系以來，Cardwell等［13］在研究食蚊魚的組織移植中也發(fā)現(xiàn)移植成功率與其MHCⅡ基因中DAB的3個(gè)位點(diǎn)的匹配率密切相關(guān)，當(dāng)Ⅱ類基因DAB位點(diǎn)所有等位基因都相同時(shí)，成功率最高;有1個(gè)等位基因不匹配時(shí)，成功率較低;2個(gè)等位基因都不相同時(shí)，成功率最低。與硬骨魚相比，軟骨魚和無頜魚類中出現(xiàn)這種排斥作用表現(xiàn)的現(xiàn)對(duì)緩慢。Hashimoto等［14］發(fā)現(xiàn)鯊魚對(duì)同種移植抗原和可溶性抗原的移植排斥現(xiàn)象較弱，而在無頜類只有慢反映現(xiàn)象。

3 MHC的表達(dá)規(guī)律

魚類MHC基因的表達(dá)規(guī)律具有組織特異性。因?yàn)镸HC基因有抗原呈遞作用，因此其與免疫應(yīng)答有直接關(guān)系，主要表達(dá)于脾、腎、胸腺、鰓等組織中。Hansen等［15］運(yùn)用RNA印跡法克隆虹鱒魚MHCⅠ類分子全長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)MHCⅠ類基因在心、腸、腎、胸腺、脾臟以及頭腎表達(dá)水平較強(qiáng)，在肌肉、腦、肝組織中表達(dá)較弱。在團(tuán)頭魴中較強(qiáng)地表達(dá)于鰓、頭腎和血液，中等程度表達(dá)于肝臟和脾臟［16］，而鮸魚在肝臟中表達(dá)量最高［17］。Cuesta等［18］報(bào)道了金頭鯛的 MHCⅡA 類基因在腹膜白細(xì)胞、頭腎、脾、胸腺和鰓中表達(dá)量較高，在腸、腦、肝和外周血中表達(dá)量較低。

MHC基因組織表達(dá)的特異性還與魚體自身免疫相關(guān)。Koppang等［19］應(yīng)用RT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)大西洋鮭在受到大西洋鮭氣單胞菌的刺激后MHCⅠ基因在肝、頭腎表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，前腸明顯下降，而在非免疫魚中該基因在脾、鰓、腸中表達(dá)量較高，在心和脾中度表達(dá)，在頭腎、肌肉、肝及腦中的表達(dá)量相對(duì)較低。此外，Koppang等還報(bào)道了非免疫的大西洋鮭的MHCⅡ基因僅在脾、鰓、前腸和后腸中表達(dá)，而免疫魚在心、肝、脾、鰓、前腸和后腸均有檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物，特別是肝和鰓的表達(dá)水平顯著提高。與組織表達(dá)相比，MHC在發(fā)育時(shí)期的表達(dá)研究較為少見。Fischer等［20］發(fā)現(xiàn)虹鱒MHCⅠα基因在受精7 d后開始表達(dá)，并且在胸腺中的表達(dá)量最高，而后期在腎和肝的淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)。與虹鱒相比，牙鲆［21］則在多細(xì)胞期、原腸期、囊胚期、神經(jīng)胚期、尾牙期、心跳期6種不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，表達(dá)水平伴隨著胚胎的發(fā)育時(shí)間其表達(dá)量逐漸增高。

4 MHC基因結(jié)構(gòu)的多態(tài)性與抗病能力的關(guān)系

4.1 魚類MHC基因的多態(tài)性 MHC基因具有高度多態(tài)性。MHCⅠ、Ⅱ類分子的抗原與外源肽和T細(xì)胞相互作用的部位是形成特定氨基酸的重要可變區(qū)域，其多樣性直接影響MHC分子與不同抗原肽的結(jié)合特性［22］，進(jìn)而導(dǎo)致不同個(gè)體對(duì)病原體易感性及抗病能力有所不同。Dijkstra等［23］發(fā)現(xiàn)虹鱒MHCⅠ類基因包含多個(gè)等位基因，其中MHCⅠβ基因的Onmy-UCA和Onmy-UDA分別有7個(gè)和8個(gè)等位基因，并且相似率超過80%。Akie Sato等［24］發(fā)現(xiàn)麗魚MHCⅠ類基因組中存在17個(gè)基因位點(diǎn)，并對(duì)其中的AU705、AU706、AU501和AU507的多態(tài)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)外顯子2能明顯影響這4個(gè)基因的多態(tài)性。

MHCⅡ類基因的多態(tài)性主要與位于相同基因座上的不同等位基因序列的差異等方面密切相關(guān)。Van等［12］報(bào)道MHCⅡB基因組中的Cyca-DAB*01、Cyca-DAB*02基因相似度為96.6%，其內(nèi)含子長(zhǎng)度均為204 bp;而Cyca-D(CB3)B、Cyca-D(CB4)B內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為669和561 bp，但其相似度卻達(dá)到89%。在個(gè)體水平上，鉸口鯊［25］、大西洋鮭［26］、金頭鯛［18］分別發(fā)現(xiàn)了2個(gè)、7個(gè)、11個(gè)MHCⅡA基因等位基因;MHCⅡB基因發(fā)現(xiàn)鱸魚［27］、真鯛［13］、大西洋鮭［28］分別含有6、7、7 個(gè)等位基因。其中，大菱鲆和真鯛1個(gè)個(gè)體最多有6個(gè)和4個(gè)等位基因位點(diǎn)，牙鲆84個(gè)個(gè)體只能出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上的等位基因。

4.2 MHC基因結(jié)構(gòu)的多態(tài)性與抗病能力的關(guān)系 MHC是脊椎動(dòng)物體內(nèi)與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)密切相關(guān)的基因家族，因此MHC基因的多態(tài)性與抗病能力有重要的關(guān)系。Nathan等［29］研究發(fā)現(xiàn)虹鱒在感染細(xì)菌性冷水病病原菌時(shí)，MHCⅠ類基因能明顯影響虹鱒的存活率，而MHCⅡ類基因則沒有影響。Grimholt等［30］發(fā)現(xiàn)大西洋鮭在感染鮭魚貧血病病毒時(shí)，MHCⅠ、Ⅱ類基因能明顯影響大西洋鮭的存活率。我國(guó)學(xué)者對(duì)尼非羅非魚［31］、“全紅”體色甌江彩鯉［32］、“粉玉”體色甌江彩鯉［33］也進(jìn)行了魚體抗病關(guān)系的研究。

ZHANG Y X［34］通過對(duì)日本牙鲆的研究，將感染鰻弧菌的存活的牙鲆根據(jù)早期感染癥狀分為抗病組和易感組，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)13個(gè)MHCⅡB等位基因Paol-allele*a～m表達(dá)量有明顯差異，結(jié)果表明抗病組還有大量的g、h等位基因，而易感組有大量的i基因。Hideki等［35］采用PCR-RF-SSCP技術(shù)在鯉魚體內(nèi)得到9種MHCⅡDAB基因A～K，鯉魚在腹腔注射嗜水氣單胞菌后，其中的6種基因型A～F在死亡和存活的鯉魚個(gè)體中分布有很大差異，基因型C的鯉魚存活個(gè)體數(shù)量是死亡個(gè)體數(shù)的3倍。

5 魚類MHC基因的多態(tài)性研究的新技術(shù)及展望

魚類MHC基因具有高度多態(tài)性以及連鎖不平衡性的特點(diǎn)，可以為提高魚類抗病性的育種選擇提供理論基礎(chǔ)和重要依據(jù)。根據(jù)不同的目的，研究魚類MHC的方法也不相同，一些分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于分析魚類MHC基因結(jié)構(gòu)與類別的差異，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFLP)、參考鏈介導(dǎo)的結(jié)合法(RSCA)和cDNA-PCR的宏基因組測(cè)序技術(shù)等。目前在研究MHC多態(tài)性過程中，通過不同的分析或結(jié)合法將不同的等位基因檢測(cè)出來，再利用測(cè)序法明確其變異位點(diǎn)，從而能夠更精確地研究魚類MHC基因。除了研究魚類MHC基因結(jié)構(gòu)，還要預(yù)測(cè)分析這些分子的三維結(jié)構(gòu)，從而判斷MHC分子與特異性抗原肽的相互關(guān)系以及MHC在組織特異性表達(dá)是如何調(diào)控的，但是這些生物學(xué)技術(shù)還不夠完善。魚類MHC基因具有高度多態(tài)性以及連鎖不平衡性的特點(diǎn)，可以為提高魚類抗病性的育種選擇提供理論基礎(chǔ)和重要依據(jù)。隨著對(duì)魚類MHC免疫進(jìn)化機(jī)制研究的不斷深入，為揭示脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的發(fā)展提供更多的途徑。

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