八角蓮愈傷組織和組培品及野生品中鬼臼毒素的HPLC分析

何軍忠， 袁家代， 李 婭， 李 維， 段輝國， 何 兵*

(1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101;2.內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川內(nèi)江641000)

八角蓮(Dysosma versipellis(Hance)M.Cheng)隸屬小檗科八角蓮屬，為我國特有的瀕危藥用保護(hù)植物.其分布零星，嚴(yán)格要求亞熱帶山地森林生境，常常局限生長在有機(jī)質(zhì)豐富、酸性至中性(pH4.2 ～7.8)透水性好的土壤中［1］.其耐蔭性的特性十分突出，對濕度的要求較高.主要分布于我國藏東南-川西-秦嶺-淮河以南海拔300～1 500 m山區(qū)，已知湖北、湖南、河南、四川、江西、安徽、浙江、廣東、廣西、云南、貴州，山西諸省均有分布［2-3］.八角蓮野外分布地區(qū)雖廣，但種群數(shù)量不大，劉海華等對恩施土家族苗族自治州八角蓮野生資源的分布及蘊(yùn)藏量等方面進(jìn)行實(shí)地調(diào)查，估算湖北產(chǎn)區(qū)的八角蓮蘊(yùn)藏量約為832.91 kg，其年允量為138.8 kg/a［4］.

八角蓮生長緩慢，種子萌發(fā)的幼苗在5～6 a后才性成熟.隨著人類活動范圍的日益擴(kuò)大，八角蓮適宜的生境正在縮小，各種群之間呈現(xiàn)明顯間斷的“島嶼狀”分布，且大種群越來越小，小種群迅速消失，甚至自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的種群也不能幸免［5-6］.各種群間基因的流動主要通過種子的傳播，而且八角蓮為異花授粉植物，自花授粉呈限制性結(jié)實(shí)，很少有蟲媒，坐果率很低，制約了天然藥物的進(jìn)一步開發(fā).其根莖入藥，具有清熱解毒、祛痰散結(jié)等功效［7-8］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中八角蓮注射液用于治療流行性出血熱、乙型腦炎、腮腺炎、毒蛇咬傷及癌癥等，特別用于食道癌和子宮癌的治療［9］.藥理研究表明，該屬植物中含有鬼臼毒素，具有抗腫瘤、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)作用，為抗癌藥VP-16和VM-26的原料［10］.

組織培養(yǎng)方面，蘭小中等［11］進(jìn)行了西藏八角蓮組織培養(yǎng)條件的篩選，認(rèn)為選用已經(jīng)萌動的芽為外植體，6-BA和NAA的比例控制在1.8/0.2，同時加入5 g/L的活性炭為最佳培養(yǎng)條件.葉耀輝等［12］以八角蓮的根莖、葉片為外植體，成功誘導(dǎo)八角蓮的愈傷組織.唐鳳鸞等［13］以八角蓮種子為外植體，對八角蓮進(jìn)行組織培養(yǎng)研究.結(jié)果表明:種子易萌芽，并且可誘導(dǎo)種子幼苗形成叢生芽;繼代繁殖在高濃度與低濃度BA或無BA的培養(yǎng)基上進(jìn)行循環(huán)培養(yǎng)效果較好;帶葉葉柄可誘導(dǎo)愈傷及根，直接形成再生植株.

八角蓮的組織培養(yǎng)品與野生品所含化學(xué)成分類型基本相同，但有效成分鬼臼毒素的含量低于野生品［14-15］.組織培養(yǎng)技術(shù)能極大提高繁殖系數(shù)，同時該技術(shù)還具有脫毒和迅速更新品種等優(yōu)點(diǎn).本實(shí)驗通過建立八角蓮組培-移栽體系，并利用HPLC測定比較八角蓮的愈傷組織和組培苗及野生植株中鬼臼毒素的含量，以期為八角蓮的引種保護(hù)和資源開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與試劑

1.1 研究對象 八角蓮(Dysosma versipellis(Hance)M.Cheng)野生植株采摘于四川雅安碧峰峽境內(nèi)，經(jīng)四川師范大學(xué)何兵副教授鑒定移栽于四川師范大學(xué)生物園內(nèi).

1.2 主要儀器 日本島津Essentia LC-15C高效液相色譜儀;日本島津WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);蘇州安泰 SW-CJ-2F 型超凈工作臺;上海立德泰勀LT-ACC300型人工氣候箱.

1.3 主要試劑 氯化高汞(HgCl2)、吐溫T-80、無水乙醇、甲醇、瓊脂、蔗糖、活性炭(AC)、6-芐基氨基酸腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、激動素(KT)、α-萘乙酸(NAA)，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，均購自成都市萇鉦化玻有限公司.

2 方法

2.1 組織培養(yǎng)

2.1.1 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基均含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的蔗糖和7 g/L瓊脂，pH為5.8～6.0.所有的培養(yǎng)基均經(jīng)121℃，0.5 MPa消毒20 min.光照強(qiáng)度為1 000 lx，光照時間為16 h/d，培養(yǎng)溫度(22±2)℃.

2.1.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 取新鮮材料，沖洗干凈后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%的酒精漂洗20 s，然后用無菌水沖洗2次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%的升汞溶液(加入2～3滴吐溫T-80)消毒8 min，接著用無菌水沖洗4～5次，外植體消毒后用無菌濾紙吸干［16-17］.葉片切成約1 cm2小塊，近軸面朝上接種培養(yǎng)基M1中;葉柄切成1 cm小段，形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基M2中;根切成1 cm小段，水平接種到培養(yǎng)基M3中.接種后放到培養(yǎng)室培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率.

2.1.3 愈傷組織分化的誘導(dǎo) 將3種愈傷組織接種至培養(yǎng)基A(MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.05%)上，培養(yǎng)15 d，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基B(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 0.05%)上，每20 d繼代一次，培養(yǎng)40 d左右，選擇成功誘導(dǎo)芽分化的愈傷組織，接種至培養(yǎng)基C(1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+AC 0.3%)上，放到培養(yǎng)室培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計愈傷分化率.

2.1.4 煉苗移栽 將已有芽分化的愈傷組織接種在培養(yǎng)基C上培養(yǎng)20～25 d，使無菌苗大量生根.當(dāng)組培苗長至5 cm左右，根5～8條時，將組培苗放置于自然環(huán)境下封口煉苗7 d，再用鑷子將苗從培養(yǎng)瓶中取出，用大量清水沖洗附在根部的培養(yǎng)基，移栽至珍珠巖與泥炭土混合(2∶1)的基質(zhì)中，在苗上覆蓋塑料薄膜，并每天對苗進(jìn)行噴霧.每7 d左右澆灌噴灑適量MS營養(yǎng)液，煉苗60 d左右移栽到園林土中，統(tǒng)計移栽存活率.

2.2 愈傷組織、組培品和野生品中鬼臼毒素的含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密量取20 mg鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≧ 98%，批號:MUST-13062701)，用無水甲醇溶液溶解并定容至10 mL容量瓶，充分搖勻，即得質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，然后利用梯度稀釋法分別配制不同濃度(0.01、0.02、0.04、0.10、0.50、1.00 mg/mL)的鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

2.2.2 供試品溶液的制備 將八角蓮3種愈傷組織(葉愈傷、葉柄愈傷、根愈傷)，組培苗不同組織(葉、葉柄、根狀莖、根)，野生品不同組織(葉、葉柄、根狀莖、根)，放置在烘箱中，于110℃殺青15 min，于50℃下烘10 h以上至恒重，然后用研缽研磨成精細(xì)粉末，過80目篩.準(zhǔn)確稱取0.5 g粉末，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%甲醇10 mL，密塞，稱重，冷浸6 h，超聲處理1 h，放冷，稱定重量，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，吸取上清液，于8 000 r/min下離心5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)相濾膜的注射器過濾，即得供試品［18-20］.

2.2.3 HPLC色譜條件 島津WondaSil C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相為甲醇 -水(50∶50，V/V);流速1 mL/min;檢測波長為290 nm;柱溫為35℃;進(jìn)樣量為20 μL.

2.2.4 線性關(guān)系的考察 取制備好的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2.3的HPLC色譜條件進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，計算回歸方程.

2.2.5 含量測定 取制備的供試品和對照品溶液，按2.2.3的HPLC色譜條件進(jìn)行測定，并計算供試品中鬼臼毒素的含量.

3 結(jié)果與分析

3.1 愈傷組織的形成 從表1可知，八角蓮根和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織誘導(dǎo)率要高于葉，差異顯著.根與葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率較接近.3者誘導(dǎo)所得的愈傷誘導(dǎo)率為:根＞葉柄＞葉.八角蓮愈傷組織在繼代過程中非常容易褐化，由傷口處分泌的酚類等有害物質(zhì)，嚴(yán)重影響愈傷組織的繼代增殖，適量的添加AC后，褐化現(xiàn)象得到明顯的遏制(圖1).

表1 不同外植體對八角蓮愈傷組織的誘導(dǎo)率影響Table 1 Effects of different explants on callus induction rate of D.versipellis

3.2 愈傷組織分化的誘導(dǎo) 將3種誘導(dǎo)的愈傷組織接種至含高濃度細(xì)胞分裂素(6-BA)的培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)接至含低濃度細(xì)胞分裂素(6-BA)的培養(yǎng)基B中.培養(yǎng)15～20 d左右發(fā)現(xiàn)，由根誘導(dǎo)的愈傷組織在繼代后生長緩慢，一段時間后就不再生長，愈傷組織逐漸老化，既無根狀分化物也無芽分化;由葉和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織有少部分(18%)出現(xiàn)不定芽的分化(圖2A).將這部分愈傷組織轉(zhuǎn)接至含低濃度細(xì)胞生長素(NAA)的培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)15～20 d左右發(fā)現(xiàn)，不定芽繼續(xù)生長成葉片，同時伴隨大量不定根的發(fā)生與生長.但多數(shù)葉片葉形不完整(非正常八角蓮葉形，圖2B)，只有少部分葉片葉形完整(圖2C).有36%左右的愈傷組織只有根分化而無芽分化(圖2D).添加 AC(0.3%)，既可以有效吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，防止褐化的發(fā)生，又能明顯促進(jìn)根的伸長生長和芽的生長.

培養(yǎng)60 d左右發(fā)現(xiàn)，由葉誘導(dǎo)的愈傷組織分化的組培苗多數(shù)葉形不完整且無側(cè)芽發(fā)生(圖2E);由葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織分化的組培苗多數(shù)葉形完整且有側(cè)芽及叢生芽的發(fā)生(圖2F)，及時切取這些側(cè)芽或是叢生芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基C中，是快速獲得大量組培苗的有效方法.

3.3 煉苗移栽 在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)60 d左右的組培苗生根效果顯著，根系較為發(fā)達(dá)，但葉片生長相對緩慢，葉片表皮薄，氣孔開閉機(jī)能弱，植物體內(nèi)水分調(diào)節(jié)能力差.所以在煉苗初期，需要將組培苗放置于自然環(huán)境下封口煉苗，使其能盡快適應(yīng)環(huán)境.移栽過程中，栽培基質(zhì)是影響組培苗存活率的重要因素.實(shí)驗證明，持水性強(qiáng)的泥炭土，配以透氣透水性好的珍珠巖作為育苗基質(zhì)，能保證組培苗的良好生長.將組培苗接到基質(zhì)上后，要盡可能保持較高的濕度環(huán)境，在苗上覆蓋塑料薄膜和定時噴霧，組培苗的移栽存活率可達(dá)90%.

3.4 愈傷組織、組培品和野生品中鬼臼毒素的含量測定

3.4.1 色譜條件的確定 由圖3可知，在設(shè)定的HPLC條件下，鬼臼毒素的保留時間約為12.94 min，與其他雜質(zhì)可實(shí)現(xiàn)基線分離.

3.4.2 線性關(guān)系的考察 計算得鬼臼毒素回歸方程為:Y=aX+b，a=1.626 263 e-003，b=0.901 968 3，R2=0.999 9.結(jié)果表明，鬼臼毒素質(zhì)量濃度在0.01～1.00 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.

3.4.3 3種愈傷組織中鬼臼毒素的含量測定 取培養(yǎng)60 d的3種愈傷組織，按2.2.2方法制備供試品，在設(shè)定的色譜條件下進(jìn)行測定.HPLC顯示(圖4)，由葉和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織中鬼臼毒素的含量高于根誘導(dǎo)的愈傷組織，差異顯著.

3.4.4 3種愈傷組織不同生長階段鬼臼毒素的含量測定 分別選取不同生長階段的3種愈傷組織(培養(yǎng) 30、60、90 d)，每一階段分別取樣 3 次，按2.2.2方法制備供試品，在設(shè)定的色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見圖5.從圖5可看出，3種愈傷組織中鬼臼毒素的含量都是隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，且在同一生長階段葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織中鬼臼毒素的含量都是最高的，分別為(1.22±0.21)、(1.98±0.32)、(2.32 ±0.12)mg·g-1DW;葉誘導(dǎo)的愈傷組織含量次之，分別為(1.01±0.24)、(1.68±0.31)、(2.12±0.28)mg·g-1DW;根誘導(dǎo)的愈傷組織含量最少，分別為(0.74±0.31)、(1.57±0.15)、(1.78 ±0.22)mg·g-1DW.在培養(yǎng)的前60 d，3種愈傷組織中鬼臼毒素的含量都有明顯的增長.從工業(yè)化生產(chǎn)的角度來看，可以選擇在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月的葉柄愈傷組織進(jìn)行鬼臼毒素的生產(chǎn)，這樣既可以省去分化成苗的環(huán)節(jié)，又能降低提取原藥材的費(fèi)用.

3.4.5 組培品和野生品中不同部位鬼臼毒素的含量測定 選取培養(yǎng)60 d左右的八角蓮組培苗的不同部位(葉、葉柄、根狀莖、根)，取樣3次;選取一年生的野生八角蓮的不同部位(葉、葉柄、根狀莖、根)，取樣3次.按2.2.2方法制備供試品，在設(shè)定的色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見圖6.從圖6可知，八角蓮的組培品與野生品所含化學(xué)成分類型基本相同，各個部位均含有鬼臼毒素，2者均以葉含量最高.組培品和野生品的葉和葉柄相比，鬼臼毒素含量無明顯差異，而2者的根狀莖和根相比，鬼臼毒素含量差異顯著(表2).從工業(yè)化的角度來看，八角蓮的葉片和葉柄都是可再生的資源，可以適時采摘八角蓮的葉片和葉柄作為提取鬼臼毒素的原材料.

表2 不同供試品中鬼臼毒素的含量比較Table 2 The podophyllotoxin contents of different specimens

俞培忠等［19］建立高效液相色譜法測定4種八角蓮中鬼臼毒素含量的方法，考察不同溶劑及提取方法對含量測定結(jié)果的影響，認(rèn)為樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的甲醇水溶液超聲波振蕩提取效果最好.潘琦等［15］比較研究了峨眉山野生八角蓮根、組培愈傷組織及其誘導(dǎo)根的鬼臼毒素含量，高效液相色譜技術(shù)(HPLC)顯示組織培養(yǎng)的八角蓮愈傷組織和誘導(dǎo)根中均含有鬼臼毒素，分別為0.117%和0.148%，野生品的根中其含量為0.600%，和本試驗的測得值相近.陳黎等［20］建立高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量，通過比較八角蓮根與根莖的HPLC圖，認(rèn)為八角蓮根中基本不含鬼臼毒素.與本試驗中的測得值不符，可能是材料的選取、提取方法或是色譜條件的不同等原因造成的.

4 討論

本試驗分別以八角蓮葉、葉柄和根為外植體，對組織培養(yǎng)及其植株再生進(jìn)行了研究，同時采用HPLC技術(shù)測定了八角蓮3種愈傷組織、組培苗和野生植株不同部位(葉、葉柄、根狀莖、根)中鬼臼毒素的含量，較全面地比較了八角蓮各組織中鬼臼毒素的分布情況.結(jié)果顯示，愈傷組織誘導(dǎo)能力:根＞葉柄＞葉;愈傷組織易誘導(dǎo)出根，而不易誘導(dǎo)出芽;在對八角蓮愈傷組織進(jìn)行增殖和植株再生培養(yǎng)時，都需要添加一定量的AC，既可以有效地防止褐化，又有利于八角蓮根、芽的生長;以珍珠巖∶泥炭土(2∶1)作為育苗基質(zhì)，苗上覆蓋塑料薄膜和定時噴霧，組培苗的移栽存活率可達(dá)90%.本試驗通過誘導(dǎo)愈傷組織的方法獲得了一定量的愈傷組織，但是愈傷組織生長緩慢，繼代培養(yǎng)不穩(wěn)定，分化能力弱，難以建立高效的愈傷組織分化成無菌苗的快繁體系.

八角蓮主要以地下根莖入藥，但其根莖呈結(jié)節(jié)狀，每年長一節(jié)，數(shù)年才能入藥用.育苗移植的八角蓮要八年以上才能收獲，利用根莖芽移栽的4 a以后才可起挖，生產(chǎn)周期太長［21］.在利益的驅(qū)動下，藥販亂采濫挖，每年的消耗量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了年生產(chǎn)量，可以預(yù)期，野生資源的不可持續(xù)性利用將進(jìn)一步制約中藥材經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展.

筆者認(rèn)為，為了合理的開發(fā)與利用八角蓮野生資源，首先必須重視八角蓮野生資源的保護(hù)，制定八角蓮就地和遷地保護(hù)的有效策略.其次應(yīng)該大力開展八角蓮野生變家種的栽培技術(shù)的研究，擴(kuò)大藥材來源的途徑.再次，通過組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行無性快速繁殖，培育大量的幼苗，縮短八角蓮成長的年限.

從工業(yè)化的角度來看，可以選擇在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月的葉柄愈傷組織進(jìn)行鬼臼毒素的生產(chǎn)，這樣既可以省去分化成苗的環(huán)節(jié)，又能降低提取原藥材的費(fèi)用.八角蓮的組織培養(yǎng)品與野生品所含化學(xué)成分類型基本相同，并且八角蓮的葉片和葉柄都是可再生的資源，適時的采摘八角蓮的葉片和葉柄作為提取鬼臼毒素的原材料，可在不破壞自然資源的前提下快速生產(chǎn)鬼臼毒素，從而為開發(fā)鬼臼毒素類抗癌藥物提供大量原料.

致謝 四川省大學(xué)生創(chuàng)新計劃項目(201410636014)對本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意.

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