磷脂酶D催化精制蛋黃磷脂酰膽堿研究

趙艷艷，程敏，張曉文

（商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛726000）

磷脂酶D催化精制蛋黃磷脂酰膽堿研究

趙艷艷，程敏，張曉文

（商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛726000）

選用磷脂酶D作為工具酶，在異辛烷、正丁醇和水構成的微乳體系中，進行了蛋黃磷脂酰膽堿的精制研究。結果表明，合理的工藝條件為：卵磷脂濃度為0.24 g·m L-1，卵磷脂與氯化膽堿質(zhì)量比為7:1，加酶量為11.0 mg·m L-1，反應溫度為40℃，反應起始pH為4.0，在該工藝條件下得到磷脂酰膽堿的轉化率達84.5%。

蛋黃磷脂酰膽堿；氯化膽堿；磷脂酶D；催化精制

卵磷脂（PC）是分布在自然界的一類含磷脂類物質(zhì)，是人體各種生物膜的構成物質(zhì)，同時也是膽堿和必需脂肪酸的主要來源，對調(diào)節(jié)機體的正常代謝，起著重要的作用[1-2]。磷脂酰膽堿是細胞膜的重要組成物質(zhì)，同時也是腦細胞傳遞信息的生物活性物質(zhì)，其在體內(nèi)水解，可以釋放出膽堿，膽堿通過合成乙酰膽堿調(diào)節(jié)腦神經(jīng)系統(tǒng)的正?；顒?，提高腦細胞活力[3]。目前，磷脂酰膽堿的提取精制方法有有機溶劑萃取法、柱層析法、超臨界二氧化碳流體萃取法、酶催化精制法等。Mary C等[4]采用丙酮沉淀法，制得卵磷脂粗品，然后用CdCl2和卵磷脂生成復合鹽沉淀，精制蛋黃磷脂酰膽堿。該法適合于制備粗磷脂，且在制備過程中帶來了有機溶劑殘留，提取效率低；許海丹等[5]通過硅膠柱層析法和三氧化二鋁柱層析法精制蛋黃磷脂酰膽堿，得到了純度90%以上的磷脂酰膽堿，該法可以制備高純度的磷脂酰膽堿，但不適宜于工業(yè)化生產(chǎn)；Henry Y S H等[6]用有機溶劑萃取后，采用超臨界CO2流體萃取技術進行萃取得到較純的卵磷脂，但是萃取的后期會出現(xiàn)蛋黃粉結塊而使得收率降低，需要的儀器設備也比較昂貴；Lekh R J等[7]采用磷脂酶催化法精制蛋黃磷脂酰膽堿，結果得到含量高達95%以上的磷脂酰膽堿。酶催化法精制磷脂酰膽堿，條件溫和，酶可以重復利用，產(chǎn)品收率高[8]。本研究采用磷脂酶D催化法精制蛋黃磷脂酰膽堿，首先以蛋黃卵磷脂為底物，磷脂酶D作為催化劑，其親核基團Y攻擊卵磷脂的酯鍵，形成卵磷脂與磷脂酶D的共價中間復合物，并從卵磷脂中釋放出一個帶負電荷的基團。此后，加入另一底物氯化膽堿。在氯化膽堿的攻擊下，底物—酶共價復合物解離，釋放出游離的酶，膽堿分子與酯鍵結合，生成新的磷脂酰膽堿，達到對卵磷脂的精制作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

蛋黃卵磷脂粗品（實驗室自制）；氯化膽堿（購自湖北巨勝科技有限公司）；Phospholipase D（購自意大利kinetika公司）。

1.2 酶催化法精制磷脂酰膽堿的合成機理

酶催化法精制磷脂酰堿的流程圖見圖1。

圖1 磷脂酰膽堿合成的流程圖

1.3 蛋黃卵磷脂粗品的制備

蛋黃粉的主要成分是卵磷脂、蛋黃油和卵黃蛋白。可以根據(jù)卵黃蛋白不溶于乙醇，而卵磷脂和蛋黃油都可溶于乙醇的原理，用乙醇提取卵磷脂；接著根據(jù)蛋黃油可溶于丙酮，卵磷脂極性較蛋黃油大，不溶于丙酮的原理，用丙酮萃取，制備蛋黃卵磷脂粗品。

稱取一定量的蛋黃粉，加入無水乙醇（料液比為1:15）在40℃的恒溫水浴鍋中提取4 h，過濾，將濾液減壓濃縮。在濃縮液中加入一定量的丙酮，攪拌，得到大量沉淀。離心分離沉淀，在70℃下烘干，制得蛋黃卵磷脂粗品。

1.4 微乳體系的構建

卵磷脂的親脂性強，稱取一定量的卵磷脂，加入到異辛烷中，超聲溶解，待完全溶解后，加入正丁醇作為助表面活性劑（卵磷脂：異辛烷：正丁醇=2 g：7 mL：1 mL），在40℃、轉速100 rpm的攪拌下，緩慢加入3 mL酶溶液，形成半透明的微乳體系。其中，卵磷脂不僅是反應的底物，也是微乳體系的表面活性劑，正丁醇是助表面活性劑，異辛烷和含酶的緩沖液分別構成了有機相和水相。

1.5 磷脂酶D催化精制磷脂酰膽堿

稱取一定量氯化膽堿（卵磷脂與氯化膽堿質(zhì)量比為7:1），用pH=4的Buffer溶液溶解后，緩慢加入到1.4所構建的微乳體系中，在40℃、轉速100 rpm的攪拌下，反應4 h（2.5 h后微乳體系開始破壞）。反應結束后，加入1 mol·L-1的NaOH溶液，在30℃下反應1 h，使得氯化磷脂酰膽堿轉變?yōu)榱字Ｄ憠A。加入甲醇：水（95:5）進行第一次萃取，將萃取液減壓濃縮后，加入水進行第二次萃取，取萃余相，濃縮，得精制的蛋黃磷脂酰膽堿。

2 結果與討論

2.1 卵磷脂濃度對反應的影響

本研究的底物為卵磷脂和氯化膽堿。在異辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL構成的微乳體系中，反應溫度40℃、反應時間4 h，初始pH4.0，加酶量11.0 mg·mL-1、卵磷脂和氯化膽堿的質(zhì)量比為7:1的條件下，研究卵磷脂濃度分別為0.06、0.12、0.24、0.36、0.48 mg·mL-1對反應結果的影響，結果見圖2。

由圖2可以看出，當卵磷脂濃度較低時，磷脂酰膽堿轉化率較低，隨著底物濃度的增加，磷脂酰膽堿的轉化率增加，當?shù)孜餄舛却笥?.24 mg·mL-1，磷脂酰膽堿的轉化率不再隨著卵磷脂濃度的增大而增加，其原因為：根據(jù)酶—底物中間復合物學說，磷脂酶D首先與卵磷脂結合，生成中間復合物，中間復合物再和氯化膽堿反應，生成磷脂酰膽堿，釋放出磷脂酶D。當卵磷脂濃度較低時，卵磷脂以單分子形式分散在微乳體系中，形成一些膠束，從而增加了和磷脂酶D結合的幾率，在磷脂酶D的作用下，卵磷脂分子親脂基團解離，氯化膽堿連接在酯鍵上，生成磷脂酰膽堿。但是隨著底物濃度的增加，獨立分散的卵磷脂分子堆疊在一起，影響了磷脂酶D與底物的結合，降低了酶解反應的轉化率。因此，反應的最適底物濃度為0.24 mg·mL-1。

圖2 卵磷脂濃度對反應的影響

2.2 溫度對反應的影響

在異辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL構成的微乳體系中，固定反應時間4 h，初始pH4.0，加酶量11.0 mg·mL-1、卵磷脂濃度0.24 mg·mL-1、卵磷脂和氯化膽堿的質(zhì)量比為7:1的條件下，研究反應溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃對反應結果的影響，結果見圖3。

從圖3可以看出，隨著溫度的增高，磷脂酰膽堿的轉化率增加，在40℃時達到最高。接著隨著溫度的升高，磷脂酰膽堿的轉化率反而下降。因為溫度對酶的催化反應有著復雜的影響，可能的機理是當反應體系溫度升高，單位時間內(nèi)分子運動速度增加，卵磷脂與磷脂酶D的有效碰撞次數(shù)增加，從而增加了酶與底物的接觸點，使得酶——底物共價復合物增多，在氯化膽堿的攻擊下，生成新的磷脂酰膽堿，釋放出游離的酶，從而使磷脂酰膽堿的轉化率增加。當酶促反應達到最適溫度時，再提高溫度，會導致磷脂酶D部分失活，反而使得酶促反應速率下降，磷脂酰膽堿轉化率下降。同時，高溫會使得氯化膽堿的季銨鹽基團發(fā)生霍夫曼降解反應，從而影響磷脂酰膽堿的轉化率，并給反應體系帶來新的雜質(zhì)。

圖3 溫度對反應的影響

2.3 pH對反應的影響

在異辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL構成的微乳體系中，固定反應時間4 h，反應溫度40℃，加酶量11.0 mg·mL-1、卵磷脂濃度0.24 mg·mL-1、卵磷脂和氯化膽堿的質(zhì)量比為7:1的條件下，研究pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5對反應的影響，結果見圖4。

圖4 pH對反應的影響

由圖3可以看出，pH對反應有一定的影響，隨著pH的增加，磷脂酰膽堿的轉化率增大，但是當pH大于4后，磷脂酰膽堿的轉化率隨著pH的增加反而下降，這是因為pH調(diào)節(jié)是提高酶在有機溶劑中催化能力的重要方法，pH通過對酶分子結構的穩(wěn)定性和解離狀態(tài)產(chǎn)生影響，從而影響酶分子的活性。當pH較低時，磷脂酶D的活性基團保持解離狀態(tài)，從而使磷脂酶D保持較高的活性，催化卵磷脂的酯鍵斷裂，形成底物——酶共價復合物，從而提高產(chǎn)物的轉化率，隨著pH的增大，磷脂酶D的活性增強，磷脂酰膽堿的轉化率增大，但是當pH大于4.0以后，磷脂酶D的活性降低，產(chǎn)物的轉化率降低。所以，反應的最適pH為4.0。

2.4 反應時間對磷脂酰膽堿轉化率的影響

在異辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL構成的微乳體系中，固定反應起始pH為4.0，反應溫度40℃，加酶量為11.0 mg·mL-1、卵磷脂濃度為0.24 g·mL-1、卵磷脂和氯化膽堿的質(zhì)量比為7:1的條件下，研究反應時間為2、3、4、5、6 h，磷脂酰膽堿的轉化率，結果見圖5。

由圖5可知，反應在2-4 h，磷脂酰膽堿的轉化率隨著反應時間的增加而增大，并逐漸趨于平衡。4 h后，繼續(xù)延長反應時間，磷脂酰膽堿的轉化率變化不明顯，主要原因可能為兩個方面：第一，磷脂酶D在微乳體系中活性較高，當反應2.5 h后，微乳體系開始破壞，到4 h微乳體系完全破壞，導致酶活性下降，磷脂酶D和卵磷脂形成的共價復合物減少，導致磷脂酰膽堿的轉化率不再增加；第二，反應的底物為卵磷脂和氯化膽堿，隨著反應時間的延長，卵磷脂和氯化膽堿不斷消耗，酶與卵磷脂的結合位點減少，磷脂酰膽堿的轉化率增加緩慢，當反應4 h以后，底物基本消耗完全，磷脂酰膽堿的轉化率增加不再明顯。所以最適反應時間為4 h。

圖5 反應時間對磷脂酰膽堿轉化率的影響

2.5 Ca2+對反應的影響

磷脂酶D的催化反應對Ca2+具有依賴性。在異辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL構成的微乳體系中，固定反應時間4 h，反應溫度40℃，起始pH4.0，加酶量11.0 mg·mL-1、卵磷脂濃度0.24 mg·mL-1、卵磷脂和氯化膽堿的質(zhì)量比為7:1的條件下，在反應體系中分別加入0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL氯化鈣CaCl2溶液（1 mol·L-1），研究Ca2+對磷脂酰膽堿轉化率的影響，結果見圖6。

圖6 Ca2+對磷脂酰膽堿轉化率的影響

由圖6可知，加入0.2、0.4 mL CaCl2溶液的反應體系和不加CaCl2溶液的反應體系，磷脂酰膽堿的轉化率沒有明顯變化，而隨著Ca2+濃度的增加，磷脂酰膽堿的轉化率逐漸下降，可能原因是：磷脂酶D的催化反應對Ca2+具有依賴性，Ca2+通過與酶分子聯(lián)接，改變酶分子的構象，提高酶活，促進磷脂酰膽堿轉化率的增加。由于蛋黃中本身含有Ca2+，能夠與磷脂酶D結合，使得反應維持較高的速率，所以加入0.2、0.4 mL CaCl2溶液的反應體系和不加CaCl2溶液的反應體系，磷脂酰膽堿的轉化率沒有明顯變化。但是隨著Ca2+濃度增加，一方面Ca2+與卵磷脂形成配合物沉淀，不利于酶與底物形成共價復合物，另一方面，高濃度的Ca2+會使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性，酶分子失活，導致磷脂酰膽堿轉化率降低。因此，本反應不需要加入Ca2+。

3 結論

本研究以磷脂酶D作為工具酶，對實驗室制備的蛋黃卵磷脂粗品進行精制，得到優(yōu)化的反應條件為：以異辛烷：正丁醇：水=7:1:0.5構成微乳體系，卵磷脂濃度為0.24 mg·mL-1，卵磷脂與氯化膽堿質(zhì)量比為7:1，加酶量11.0為mg·mL-1，反應溫度為40℃，反應起始為pH為4.0。在該條件下，磷脂酶D能夠較好的與底物結合，將其他磷脂轉變?yōu)榱字Ｄ憠A，從而達到對卵磷脂的精制。

[1]孫清瑞,鹿保鑫,劉志明,等.化學催化法制備甘油磷酸膽堿的研究[J].糧油加工,2009,11(11):56-58.

[2]趙艷艷.甘油磷酸膽堿的穩(wěn)定性研究[J].商洛學院學報,2013,27(6):75-77.

[3]常皓.蛋黃卵磷脂的提取、分析及氧化穩(wěn)定性研究[D].長春:吉林大學,2012:35-37.

[4]Mary C,Pangborn.A simplified purification of lecithin[J].J Biol Chem,1951,188:471-476.

[5]許海丹.蛋黃卵磷脂的精制工藝及其穩(wěn)定性研究[D].杭州:浙江大學,2005:24.

[6]Henry Y S H,Mehdi A K,Larry T,et al.Analytical scale supercritical fluid fractionation and identification of single polar lipids from deoiled soybean lecithin [J].J Sep Sci,2008,31:1290-1298.

[7]Lekh R J,Tsuneo Y,Sholchi S.Enzymatic method of increasing phosphatidylcholine content of lecithin[J]. JAOCS.1989,66(5):714-717.

[8]秦德元,張鵬.酶法合成EPA／DHA型卵磷脂[J].中國油脂，2004,29(9):45-47.

（責任編輯：李堆淑）

Catalytic Purification of Egg Yolk Lcithin by Phospholipase D

ZHAO Yan-yan，CHENG Min，ZHANG Xiao-wen
(Collgeg of Biopharmateutical and Food Engineering,Shangluo University，Shangluo 726000,Shaanxi)

Egg yolk lecithin was purified by phospholipase D in microemulsion system which was made by isooctane,n-butanol and water.The optimum reaction conditions were as follows:the concentration of PC was 0.24 g·mL-1，mass ratio of PC to choline chloride was 7:1,lipase D dosage was 11.0 mg·mL-1,reaction temperature was 40℃,reaction pH was 4.0.Under the optimum conditions,the conversion rate of phosphatidylcholine was 84.5%。

egg yolk lecithin;choline chloride;phospholipase D;catalytic purification

R927

A

1674-0033（2015）06-0067-04

10.13440/j.slxy.1674-0033.2015.06.016

2015-10-15

商洛學院科研基金項目（13SKY011）

趙艷艷，女，陜西洛南人，碩士，講師