響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取狀元豆多糖工藝*

黎英，尤雙圳，賴丹妮，陳雪梅，石小瓊

(龍巖學(xué)院，福建龍巖，364012)

狀元豆學(xué)名萊豆，是閩西地區(qū)種植歷史悠久的一年蔓性大萊豆品種［1］，其具有喜溫怕冷的生長(zhǎng)習(xí)性，適宜海拔600米以上廣東和福建地區(qū)種植［2］，在民間常作為利尿化濕、健脾的保健蔬菜食用，具有祛濕、補(bǔ)血、健胃、強(qiáng)腎、養(yǎng)顏防衰、抑制癌細(xì)胞、通便、防止骨質(zhì)疏松老等功效［3-4］。

多糖是一類具有多種生物活性功能的高分子化合物，在臨床上對(duì)腫瘤、肝炎、心臟病、神經(jīng)衰弱均有一定療效［5］。近年來的研究也證明，多糖除具有抗氧化、抗病毒、抗輻射、抗腫瘤、抗疲勞及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞等生物活性外，還具有抗凝血、抗血栓、降血糖、降血脂、延緩衰老等特性，甚至對(duì)艾滋病病毒也有一定的防御功能［6-7］。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于多糖的提取研究報(bào)道較多，但鮮見對(duì)狀元豆多糖的提取工藝研究的報(bào)道。本研究在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，用超聲波技術(shù)輔助提取狀元豆多糖，再通過響應(yīng)面分析法對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

狀元豆，由龍巖上杭農(nóng)科所提供;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma化學(xué)公司;石油醚、葡萄糖、無水乙醇、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、H2SO4、苯酚等。均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ102型微型植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;FD-1-50型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SK8210LHC型超聲波清洗機(jī)，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;TB-114型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHB-3型循環(huán)水多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠;TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-2102C型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ［8-12］

2.1 狀元豆多糖的超聲波提取

將干燥過的狀元豆粉碎過40目篩，用濾紙包成圓柱形，加入3倍體積的石油醚，用索氏抽提裝置80℃回流脫脂4 h，再用3倍體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇回流2次，2 h/次，除去生物堿、低聚糖、揮發(fā)油等小分子物質(zhì)。冷凍干燥后備用。稱取5.0 g預(yù)處理過的狀元豆粉，加蒸餾水浸制后，懸浮液按試驗(yàn)設(shè)定的條件進(jìn)行超聲波提取，將提取液離心(3 000 r/min，15 min)，沉淀物按照同樣的提取條件重復(fù)提取2次，合并上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。向濃縮液加入Sevag試劑振蕩去蛋白后加入4倍體積的95%乙醇，放入4℃冷藏柜中靜置，12 h后離心(4 000 r/min，10 min)得沉淀，再依次用乙醇、丙酮反復(fù)振動(dòng)洗滌3次，最后真空冷凍干燥，即得狀元豆多糖粗提物。

2.2 狀元豆多糖提取率的測(cè)定

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取葡萄糖(經(jīng)105℃干燥至質(zhì)量恒定)標(biāo)準(zhǔn)樣品10.00 mg，用蒸餾水溶解并定溶于100 mL容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，于100 mL容量瓶中并加蒸餾水定容搖勻備用。然后精確移取上述各溶液2 mL置于具塞刻度試管中，各加入體積分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液1.0 mL和濃H2SO45 mL，充分混勻，室溫靜置30 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以0號(hào)管為空白對(duì)照，以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

分別移取6份同一狀元豆多糖供試樣品溶液各2.0 mL，置于具塞試管中，按2.2.1方法操作測(cè)定吸光度，重復(fù)6次。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密移取2.0 mL狀元豆多糖供試樣品溶液按2.2.1 方法操作，分別在 10、30、60、90、120、150、180 min時(shí)測(cè)定溶液吸光度。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別移取在同一提取條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作6次獲得的狀元豆多糖供試樣品溶液各2.0 mL共6份，置于具塞試管中，按2.2.1方法操作測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量。

2.2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密移取2.0 mL狀元豆多糖供試樣品溶液5份，分別加入不同體積的0.010 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2.1方法操作測(cè)定吸光度，按以下公式計(jì)算加標(biāo)回收率。

2.2.6 狀元豆多糖提取率計(jì)算

將狀元豆粗多糖溶解并稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，移取2.0 mL狀元豆粗多糖樣品液按2.2.1方法操作，于490 nm處測(cè)定其吸光度，重復(fù)3次，取平均值。按以下公式計(jì)算多糖提取率。

式中:c為提取的樣品液多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL;V0為樣品液的總體積，mL;n為稀釋倍數(shù);V為樣品測(cè)定液的體積，mL;m為稱取的預(yù)處理狀元豆粉的質(zhì)量，g。

2.3 狀元豆多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

用蒸餾水作溶劑進(jìn)行提取，分別考察液固比、超聲功率、超聲時(shí)間及提取溫度4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)狀元豆多糖提取率的影響程度，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 液固比對(duì)狀元豆多糖提取率的影響

稱取預(yù)處理過的狀元豆粉5.0 g，按液固10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL∶g)的比例加入蒸餾水，在溫度50℃，功率200 W條件下超聲處理30 min，按2.1、2.2.1及2.2.6實(shí)驗(yàn)方法提取粗多糖、測(cè)定提取液吸光度并計(jì)算多糖提取率，繪制曲線。

2.3.2 超聲功率對(duì)狀元豆多糖提取率的影響

稱取預(yù)處理過的狀元豆粉5.0 g，選取2.3.1獲得的最適液固比加入蒸餾水，在溫度50℃條件下，分別在超聲功率 200、250、300、350、400 W 條件下處理30 min，按2.1、2.2.1及2.2.6實(shí)驗(yàn)方法提取粗多糖、測(cè)定提取液吸光度并計(jì)算多糖提取率，繪制曲線。

2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)狀元豆多糖提取率的影響

稱取預(yù)處理過的狀元豆粉5.0 g，選取2.3.1和2.3.2獲得的最佳液固比和功率，在溫度50℃條件下，分別超聲處理 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，按 2.1、2.2.1及2.2.6實(shí)驗(yàn)方法提取粗多糖、測(cè)定提取液吸光度并計(jì)算多糖提取率，繪制曲線。

2.3.4 提取溫度對(duì)狀元豆多糖提取率的影響

稱取預(yù)處理過的狀元豆粉5.0 g，選取2.3.1～2.3.3獲得的最佳液固比、功率和時(shí)間，依次以20、30、40、50、60 ℃ 為提取溫度，按 2.1、2.2.1 及 2.2.6實(shí)驗(yàn)方法提取粗多糖、測(cè)定提取液吸光度并計(jì)算多糖提取率，繪制曲線。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)確定的提取條件下，以液固比、超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度4個(gè)試驗(yàn)因素為考察因素，以狀元豆多糖提取率為考察指標(biāo)，稱取3份預(yù)處理過的狀元豆粉各5.0 g，做3次平行實(shí)驗(yàn)，按2.1、2.2.1及2.2.6實(shí)驗(yàn)方法提取粗多糖、測(cè)定提取液吸光度并計(jì)算多糖提取率，再采用Minitab15軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，建立數(shù)學(xué)回歸模型，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 狀元豆多糖提取率的Box-Behnken因素與水平編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design on the extraction yield of beans champion polysaccharides

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度c及對(duì)應(yīng)的吸光度值A(chǔ)的關(guān)系，得到苯酚-硫酸法測(cè)定多糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:C=0.133 39A-0.000 7，相關(guān)系數(shù)R=0.999 6，在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，供試狀元豆多糖樣品的RSD為2.834%，表明用硫酸-苯酚法測(cè)定狀元豆多糖含量精密度較高。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of Precision test

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可看出，供試狀元豆多糖樣品溶液的吸光度在120 min內(nèi)每隔30 min保持穩(wěn)定，在150 min后開始下降，說明樣品提取液按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在30 min左右時(shí)間測(cè)定的吸光度穩(wěn)定好，能達(dá)到一般分光光度計(jì)的要求。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of Stability test

3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，供試樣品狀元豆多糖的含量平均為0.047 59 mg/mL，相對(duì)偏差為1.368%，說明該方法測(cè)定狀元豆多糖含量的重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of Repeatability test

3.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5結(jié)果可知，供試狀元豆多糖樣品加標(biāo)后回收率在95.97%～102.47%，平均回收率為99.64%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.87%，說明該方法加標(biāo)回收率高，準(zhǔn)確度好。

表5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of recovery rate test

3.6 狀元豆多糖提取工藝參數(shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

3.6.1 液固比對(duì)狀元豆多糖提取率的影響

由圖2可知，液固比為10∶1(mL∶g)時(shí)的狀元豆多糖提取率并不高，但隨著溶劑量的增大，提取率相應(yīng)地增大，而當(dāng)液固比超過30∶1后稍略有下降?？赡苁钱?dāng)溶劑量少，物料黏度大，擴(kuò)散速度慢，提取不完全;但溶劑量過多可能導(dǎo)致溶劑對(duì)超聲波有一定的吸收而使超聲波破碎細(xì)胞程度下降，降低多糖的溶出量。并且考慮到增加水量不利于后期蒸發(fā)濃縮，在保證提取效果的同時(shí)，應(yīng)盡量減少水用量和降低蒸發(fā)濃縮的負(fù)荷。因此液固比選在20∶1～40∶1(mL∶g)比較合適。

圖2 液固比對(duì)狀元豆多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ratio liquid to solid on the extraction yield of polysaccharides from beans champion

3.6.2 超聲功率對(duì)狀元豆多糖提取率的影響

從圖3可以看出，狀元豆多糖提取率在超聲功率300W時(shí)達(dá)到最大值，而后隨著超聲波功率的增大，多糖提取率反而有下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)槌暡ǖ墓β逝c其作用有一定關(guān)系，一般功率越高，空化越強(qiáng)烈，可快速有效地促進(jìn)植物細(xì)胞破壁破裂，加速提取溶劑對(duì)狀元豆細(xì)胞內(nèi)多糖的滲透，但功率如果過高，反而會(huì)相應(yīng)產(chǎn)生大量無用的氣泡，同時(shí)增加散射衰減，并形成聲屏障，并且過高的功率易引起局部溶液瞬間升溫，造成部分多糖分子結(jié)構(gòu)的斷裂，導(dǎo)致提取率降低。因此，確定超聲功率250～350W為最佳試驗(yàn)條件。

圖3 超聲功率對(duì)狀元豆多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from beans champion

3.6.3 超聲時(shí)間對(duì)狀元豆多糖提取率的影響

由圖4可知，在2～3 h內(nèi)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，狀元豆多糖提取率增加明顯，呈正相關(guān);時(shí)間超過3h后提取率變化不明顯，并且有所下降。可能時(shí)間小于2 h時(shí)，狀元豆中的多糖還沒有完全被浸提處理，而3 h后，多糖可能已經(jīng)達(dá)到最大溶解狀態(tài)，同時(shí)可能因?yàn)椴糠侄嗵窃陂L(zhǎng)時(shí)間的超聲波機(jī)械剪切力作用下被降解或某些熱敏性多糖類成分因發(fā)生長(zhǎng)時(shí)間高頻運(yùn)動(dòng)下而被熱降解成小分子而造成損失。同時(shí)從節(jié)省能源角度考慮，提取時(shí)間也不能過長(zhǎng)。因此綜合考慮2～3 h超聲時(shí)間較適宜。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)狀元豆多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides from beans champion

3.6.4 提取溫度對(duì)狀元豆多糖提取率的影響

從圖5可以看出，溫度對(duì)提取狀元豆多糖的影響較大，溫度越高，狀元豆多糖提取率越高。這可能是因?yàn)闇囟壬?，狀元豆顆粒逐漸軟化和變形，而溶劑分子因熱效應(yīng)加速進(jìn)入狀元豆顆粒的內(nèi)部，使多糖的滲透力和溶解力加強(qiáng)，進(jìn)而使多糖從細(xì)胞中更容易轉(zhuǎn)移到水溶劑中。但因需同時(shí)考慮提取溫度60℃是超聲波清洗器的最高工作溫度，如果長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)對(duì)超聲波器儀造成一定的損壞。所以提取溫度選擇50℃左右比較合適。

圖5 提取溫度對(duì)狀元豆多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extracting temperature on the extraction yield of polysaccharides from beans champion

3.7 狀元豆多糖提取工藝參數(shù)優(yōu)化

3.7.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)確定的最佳水平基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken軟件中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)，其中24個(gè)分析因子試驗(yàn)，5個(gè)零點(diǎn)試驗(yàn)。優(yōu)化超聲波輔助提取狀元豆多糖的工藝條件。設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案和結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 6 Box-Behnkenl central composite design arrangement and experimentral results

3.7.2 回歸模型的建立和方差分析

使用響應(yīng)面分析法對(duì)表6中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得到液固比、超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度相關(guān)回歸系數(shù)，其回歸方程為:

Y=-55.809 75+0.362 6A+0.128 88B+11.676 67C+0.875 67D+4.100 00E-004AB+0.027 000AC-3.20 000E-003AD-1.300 00E-003BC+1.050 00E-005BD-0.039 500CD-6.357 50E-003A2-2.293 00E-004B2-1.953 00C2-7.082 50E-003D2

進(jìn)一步對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，所得的方差分析見表7。

表7 狀元豆多糖提取率的回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation on the extraction yield of beans champion polysaccharides

由表7可知，回歸二次方程模型的P＜0.000 1(極顯著)，而失擬項(xiàng)P=0.999 4＞0.05(不顯著)，說明正交試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型擬合程度良好，可用模型來分析和預(yù)測(cè)狀元豆多糖的提取工藝條件。決定系數(shù)R2=0.970 8，與校正決定系數(shù)Adj.R2=0.941 6相近，表明狀元豆多糖提取率預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值有較好的擬合度。次變異系數(shù)CV=2.25%，也說明模型的置信度較高，試驗(yàn)的可靠性和精確度較好。同時(shí)，由表7的F值大小可知，4個(gè)因素對(duì)狀元豆多糖提取率影響顯著程度排序?yàn)?超聲功率＞超聲時(shí)間＞液固比＞提取溫度;且各因素交互作用對(duì)狀元豆多糖提取率的影響強(qiáng)弱依次為:AD＞AB＞CD＞AC＞BD＞BC;二次項(xiàng)中4個(gè)因素對(duì)狀元豆多糖提取率的影響都達(dá)到極顯著水平。

3.7.3 兩因素交互作用分析

4個(gè)因素兩兩交互作用的三維響應(yīng)面圖，如圖6所示。

圖6 各因素對(duì)多糖提取率影響的等高線及響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of effect of interactions between every two factors on the extraction yield of beans champion polysaccharides

依據(jù)響應(yīng)面的等高線的形狀越接近橢圓形和曲面傾斜度越陡，響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件改變的敏感程度越大，因素間交互作用越顯著，反之則交互作用不顯著。由圖6可看出，4個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響都呈先增大后減的趨勢(shì)。液固比和提取溫度，以及液固比和超聲功率的交互作用極顯著;超聲時(shí)間和提取溫度交互作用顯著;而液固比和超聲時(shí)間、超聲功率和提取溫度以及超聲功率和超聲時(shí)間沒有顯著地交互作用。

3.7.4 最佳工藝參數(shù)的選取

由Box-Behnken軟件計(jì)算出狀元豆多糖提取的最佳工藝條件為:液固比38.85∶1(mL∶g)，超聲功率319.18 W，超聲時(shí)間2.67 h，提取溫度47.98℃，在此參數(shù)下預(yù)測(cè)的總多糖提取率6.78%。考慮實(shí)際條件的可操作性，將條件適當(dāng)調(diào)整為液固比39∶1(mL∶g)，超聲功率319 W，超聲時(shí)間2.7 h，提取溫度48℃，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，狀元豆多糖提取率平均為6.74%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.59%，差異不明顯。因此，利用響應(yīng)面法優(yōu)化出的提取工藝參數(shù)基本準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)論

(1)通過對(duì)顯色的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加標(biāo)回收率的考察，結(jié)果表明，利用硫酸-苯酚分光度計(jì)法測(cè)定分析狀元豆多糖含量的方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、靈敏、重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，可用于狀元豆多糖含量的測(cè)定。

(2)狀元豆多糖最佳提取條件為:液固比39∶1(mL∶g)，超聲功率319 W，超聲時(shí)間2.7 h，提取溫度48℃，通過3次驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下狀元豆多糖提取率平均為6.74%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.59%，差異不顯著。

(3)4個(gè)因素對(duì)狀元豆多糖提取率影響的程度排序?yàn)?超聲功率＞超聲時(shí)間＞液固比＞提取溫度。

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