離子排斥色譜法分析發(fā)酵液中甘油酸等代謝產(chǎn)物*

方亞坤，靳魁奇，劉宇鵬

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開(kāi)封，475004)

甘油是一種多羥基化合物，為甘油三脂的骨架成分，是脂肪分解和生物柴油燃料生產(chǎn)(這一過(guò)程會(huì)產(chǎn)生約10%～14%左右的甘油)［1］過(guò)程中的一種副產(chǎn)品。甘油具有很多的工業(yè)用途，它被廣泛地應(yīng)用于化妝、涂料、汽車(chē)、食品、煙草、制藥和紡織工業(yè)等［2］。隨著生物燃料的發(fā)展，越來(lái)越多的甘油副產(chǎn)物產(chǎn)生，因此在過(guò)去的十年間，化學(xué)和生物工程的研究者付出很多努力探索將甘油轉(zhuǎn)化成具有更高價(jià)值化學(xué)物質(zhì)的方法［3］。而氧化甘油轉(zhuǎn)化為1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、二羥基丙酮、甘油酸等物質(zhì)則是其中一條重要途徑。

甘油酸又稱(chēng)2，3-二羥基丙酸，它是自然界各種各樣植物中的化學(xué)成分，作為一種代謝物它在人體內(nèi)也存在。甘油酸以及甘油酸的衍生物具有很好的生物學(xué)功能:在人體內(nèi)D-甘油酸能使胃部細(xì)胞在一定劑量乙醇刺激后增強(qiáng)活力從而促進(jìn)乙醇分解代謝;有報(bào)道稱(chēng)在狗體內(nèi)的甘油酸具有膽固醇活性和肝興奮劑的功能;甘油酸衍生出的酯類(lèi)低聚物能表現(xiàn)出抗胰蛋白酶活性［4-5］，甘油酸的磷酸鹽衍生物是糖酵解途徑的一個(gè)重要中間產(chǎn)物。所以氧化甘油生產(chǎn)甘油酸，可充分利用生物燃料行業(yè)的廢棄物，具有很大的市場(chǎng)潛力。氧化甘油生產(chǎn)甘油酸有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)方法成本高、耗能大、產(chǎn)量低并且不具有立體選擇性因而很少被采用。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘油酸，環(huán)境溫和、產(chǎn)量高、方法簡(jiǎn)便而且產(chǎn)物具有立體選擇性，因此越來(lái)越受到關(guān)注。但是，目前國(guó)外關(guān)于甘油酸發(fā)酵的研究非常少，國(guó)內(nèi)還尚無(wú)任何關(guān)于甘油酸發(fā)酵的研究報(bào)道［6-8］。據(jù)報(bào)道，在有氧條件下利用細(xì)菌生產(chǎn)甘油酸的菌種大多屬于醋酸桿菌屬，它們?cè)谘趸视偷纳a(chǎn)過(guò)程中會(huì)生成副產(chǎn)物二羥基丙酮。

通常測(cè)定發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法［9］包括酶法、氣相色譜法(GC)及高效液相色譜法(HPLC)。HPLC法靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，不需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，因此本文首次嘗試采用HPLC法同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵液中的甘油酸、二羥基丙酮和甘油的含量。檢測(cè)時(shí)選擇高交聯(lián)度磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物多孔微球作為固定相的Aminex HPX-87H離子色譜柱為分析柱，該色譜柱以離子排斥法為主，并且集合了離子交換、配位體交換、反相及正相等多種分離機(jī)制，這種多方式的交互作用具有很好的分離混合物的能力［10］。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未有同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵液中甘油酸、二羥基丙酮和甘油的報(bào)道。此外，本文還研究了不同分析色譜條件對(duì)甘油酸、甘油和二羥基丙酮分離效果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器及色譜條件

1.1.1 儀器

Waters 1515高效液相色譜儀、Waters2414示差折光檢測(cè)器、Waters 2489紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、2707自動(dòng)進(jìn)樣器、Breeze色譜工作站，美國(guó);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科技工貿(mào)有限公司;QHZ-98A全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

1.1.2 色譜條件

色譜分離柱:BioRad公司Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm ×7.8 mm×9 μm);Waters 2414示差折光檢測(cè)器。

起始色譜條件:流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4;柱溫60 ℃;流速 0.5 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

優(yōu)化后色譜條件:流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4和20%乙腈;柱溫 60℃;流速 0.3 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

1.2 材料與試劑

1.2.1 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品甘油酸(20%水溶液，東京化成工業(yè)株式會(huì)社);二羥基丙酮;甘油。以上標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純。乙腈和濃H2SO4均為色譜純。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

菌種:氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans 1.637)，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

種子培養(yǎng)基(g/L):多聚蛋白胨5，酵母粉 5，葡萄糖 5，MgSO4·7H2O 1，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油100，多聚蛋白胨 9，酵母粉 1，KH2PO40.9，K2HPO40.1，MgSO4·7H2O 1，pH 6.5。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱(chēng)取二羥基丙酮標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g，置于25 mL的容量瓶中，用含20%乙腈的5 mmol/L的H2SO4稀釋至刻度線，得到濃度為2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密吸取1、2、3、4、5 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別置于10 mL容量瓶中，用20%乙腈5 mmol/L的H2SO4稀釋至刻度線。得到梯度濃度的二羥基丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

甘油酸的標(biāo)準(zhǔn)品為20%的水溶液(2 mol/L)，取236 μL 20%的甘油酸標(biāo)準(zhǔn)品置于25 mL容量瓶中用含20%乙腈的5 mmol/L的H2SO4稀釋至刻度線得到2 g/L的甘油酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。然后按照和二羥基丙酮同樣的方法進(jìn)行稀釋。

利用和二羥基丙酮同樣的方法來(lái)配制甘油的不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 發(fā)酵條件

一級(jí)種子培養(yǎng):30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子培養(yǎng):30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。

發(fā)酵培養(yǎng):種子生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)，按5%的接種量接入500 mL的三角瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

1.3.3 樣品處理

取10 mL發(fā)酵液，經(jīng)離心除去菌體和沉淀物，然后將離心所得上清液稀釋10倍，再用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾得到濾液放入冰箱備用。

1.3.4 甘油酸的提取與純化［11］。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

甘油酸屬于一種有機(jī)酸，實(shí)驗(yàn)中選擇了Aminex HPX-87H離子排斥色譜柱來(lái)分析發(fā)酵液中的甘油酸、二羥基丙酮和甘油等物質(zhì)。據(jù)Chinnici［12］等人報(bào)道，Aminex HPX-87H色譜柱可以使用 H2SO4和H3PO4作為流動(dòng)相來(lái)分析有機(jī)酸和糖類(lèi)。因?yàn)镠3PO4有可能和發(fā)酵液中的金屬離子產(chǎn)生沉淀，所以本文選用了H2SO4作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2SO4作為流動(dòng)相時(shí)溫度的變化對(duì)物質(zhì)的分離效果沒(méi)有顯著影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘油酸和二羥基丙酮與甘油的分離效果良好，但是由于二羥基丙酮與甘油的結(jié)構(gòu)式相似，在不同的流速下發(fā)酵的副產(chǎn)物二羥基丙酮和剩余的甘油的分離效果不是很理想，因此本實(shí)驗(yàn)選擇在流動(dòng)相中添加了一定濃度的乙腈以改善分離效果。

2.2 流動(dòng)相中乙腈的濃度及流速的條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在色譜柱溫對(duì)發(fā)酵液中各成分的分離影響較大(數(shù)據(jù)未列出)。柱溫為常溫時(shí)分離效果較差;柱溫為高溫(40～60℃)時(shí)分離效果較好，因而本文選用的色譜柱溫為60℃。在實(shí)驗(yàn)中，選擇乙腈濃度和流速兩個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。其中流動(dòng)相中乙腈濃度分別為10%，15%，20%，流速分別選擇了0.3，0.4，0.5，0.6 mL/min，共 12 個(gè)分析條件，甘油酸、甘油、二羥基丙酮等混合標(biāo)準(zhǔn)品的分析結(jié)果如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘油酸色譜峰的保留時(shí)間與二羥基丙酮和甘油相距較大，因而甘油酸很容易和其他物質(zhì)分開(kāi)，但底物甘油和副產(chǎn)物二羥基丙酮的分離比較困難。從圖1中可以看出，當(dāng)流速一定時(shí)，隨著流動(dòng)相中乙腈含量的升高，甘油和二羥基丙酮的分離效果得到提高，因而選擇20%的乙腈含量為最終的分析條件。在乙腈濃度為20%時(shí)，隨著流動(dòng)相流速的增加，甘油和二羥基丙酮的保留時(shí)間趨于一致，分離效果變差，因而選擇流速為0.3 mL/min。使用優(yōu)化后的色譜條件，對(duì)甘油酸、甘油、二羥基丙酮混合標(biāo)樣進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，表明3種物質(zhì)得到了良好的分離。

圖1 乙腈濃度和流動(dòng)相流速對(duì)甘油酸、甘油、二羥基丙酮保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of flow rate and concentration of mobile phase on retentiontime of glyceric acid，dihydroxyacetone and glycerol

圖2 優(yōu)化后的混合標(biāo)樣色譜圖Fig.2 Optimized HPLC figure of mixed standard sample

2.3 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

按照1.3.1的方法配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以峰面積外標(biāo)法定量，然后根據(jù)峰面積(Y)和標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1所示。

表1 甘油酸、二羥基丙酮和甘油的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(n=5)Table 1 The regression equation，correlation coefficient and linear range of glyceric acid，dihydroxyacetone and glycerol(n=5)

從表1的結(jié)果可以看出甘油酸、二羥基丙酮和甘油各組分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)與分析方法的精密度

取100 mL空白發(fā)酵液，分別加入標(biāo)準(zhǔn)樣品甘油酸、二羥基丙酮和甘油1.0 g，采用與樣品相同的處理方法和相同的色譜條件，每個(gè)標(biāo)品重復(fù)5次。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 甘油酸、二羥基丙酮和甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率和精密度(n=5)Table 2 Recovery rate and precision of the glyceric acid，dihydroxyacetone and glycerol(n=5)

從表2中可以看出，該方法對(duì)于甘油酸、二羥基丙酮和甘油的分離檢測(cè)效果良好，他們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.31%、1.35%和1.61%，說(shuō)明該方法的精密度較好。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一個(gè)發(fā)酵的樣品按1.3.3的方法處理，并按上述一樣的色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣8次。計(jì)算甘油酸、二羥基丙酮和甘油的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.46%、1.72%、1.87%，說(shuō)明該方法對(duì)甘油酸、二羥基丙酮和甘油的重現(xiàn)性較好。

2.6 發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定

取不同的5批發(fā)酵液，按照1.3.3的處理方法對(duì)這5批發(fā)酵液進(jìn)行處理，然后按照上述相同的色譜條件進(jìn)行分析檢測(cè)色譜結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵液的液相色譜圖Fig.3 The HPLC figure of fermentation broth

3 結(jié)論

本文采用Aminex HPX-87H為色譜柱建立對(duì)甘油酸、二羥基丙酮和甘油進(jìn)行分離檢測(cè)方法，但是以5 mmol/L H2SO4為流動(dòng)相時(shí)二羥基丙酮和甘油的分離效果不好，對(duì)此本研究對(duì)流動(dòng)相中乙腈的濃度和流速進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為乙腈濃度為20%、流速0.3 mL/min。在此方法下，甘油酸、二羥基丙酮和甘油在0.2～1.0 g/L線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999、0.994和0.992，線性關(guān)系良好，彼此的平均回收率分別為(99.52 ±1.30)%，(97.61±1.33)%，(98.52±1.58)%。分離效果高，精密度和準(zhǔn)確度較好。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有分離效果好、定性及定量準(zhǔn)確、分析時(shí)間較短等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于分析發(fā)酵液中有機(jī)酸、多元醇及酮類(lèi)物質(zhì)具有很好的參考價(jià)值，非常適合于微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)甘油酸過(guò)程中底物及產(chǎn)物的及時(shí)分析與監(jiān)測(cè)。

［1］ Habe H，F(xiàn)ukuoka T，Kitamoto D，et al.Biotransformation of glycerol to D-glyceric acid by Acetobacter tropicalis［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81(6):1 033-1 039.

［2］ Habe H，F(xiàn)ukuoka T，Kitamoto D，et al.Biotechnological production of D-glyceric acid and its application［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84(3):445-452.

［3］ Habe H，Shimada Y，F(xiàn)ukuoka T，et al.Production of glyceric acid by Gluconobacter sp.NBRC3259 using raw glycerol［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2009，73(8):1 799-1 805.

［4］ 盧英華，陳慧敏，蒲洋，等.一種用于生產(chǎn)甘油酸的熱帶醋桿菌的馴化方法［P］.中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利.CN104263689A，2015-01-07.

［5］ Sato S，Morita N，Kitamoto D，et al.Change in product selectivity during the production of glyceric acid from glycerol by Gluconobacter strains in the presence of methanol［J］.AMB Express，2013，3(1):20-26.

［6］ Sato S，Morita T，Habe H，et al.Microbial resolution of DL-glyceric acid for L-glyceric acid production with newly isolated bacterial strains［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2015，119(5):554-557.

［7］ Roncal T，Mu?oz C，Lorenzo L，et al.Two-step oxidation of glycerol to glyceric acid catalyzed by the Phanerochaete chrysosporium glyoxal oxidase［J］.Enzyme and Microbial Technology，2012，50(2):143-150.

［8］ Yakushi T，Matsushita K.Alcohol dehydrogenase of acetic acid bacteria:structure，mode of action，and applications in biotechnology［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，86(5):1 257-1 265.

［9］ 劉宇鵬，鄭璞，孫志浩，等.采用離子排斥色譜法分析發(fā)酵液中的琥珀酸等代謝產(chǎn)物［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(12):119-123.

［10］ 馬建剛，劉嬌，曾祥峰，等.大腸桿菌9種有機(jī)酸代謝產(chǎn)物的高效液相檢測(cè)條件優(yōu)化［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27(5):591-594.

［11］ Habe H，Shimada Y，Yakushi T，et al.Microbial production of glyceric acid，an organic acid that can be mass produced from glycerol［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(24):7 760-7 766.

［12］ Chinnici F，Spinabelli U，Riponi C，et al.Optimization of the determination of organic acids and sugars in fruit juices by ion-exclusion liquid chromatography［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2005，18(2):121-130.