殼聚糖-聚酰胺法組合純化甜葉菊廢渣中黃酮*

羅序燕，方浩斌，趙東方，黃瑞宇，鄧金梅，祝婷，謝小華

(江西理工大學(xué)冶金與化學(xué)工程學(xué)院，江西贛州，341000)

我國是世界上最大的甜菊糖產(chǎn)品生產(chǎn)供應(yīng)國，約占全球總產(chǎn)量的90%［1］，其原料甜葉菊中除甜菊糖外，還含有黃酮、萜類、酚類、有機(jī)酸等［2］。提取甜菊糖后會(huì)排出大量廢渣，造成資源的浪費(fèi)，從中提取并純化天然活性物質(zhì)是一種很好的解決方式，其中黃酮類化合物因具有降血壓血脂、抗氧化、抗癌、抗腫瘤［3-7］等功效而產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益，是天然物質(zhì)研究的熱點(diǎn)。關(guān)于黃酮類化合物純化工藝的研究有很多，主要方法有柱層析、絮凝沉淀、膜分離［8-10］等。目前大孔樹脂［11］和聚酰胺［12］為吸附劑的柱層析法，大孔樹脂的報(bào)道最多，但對(duì)其吸附理論方面研究不足而導(dǎo)致樹脂合成缺乏針對(duì)性，吸附選擇性較差［13］。而聚酰胺的酰胺基吸附、“氫鍵吸附”［14］等機(jī)理證明其對(duì)黃酮等酚類化合物有獨(dú)特的選擇性，但因?qū)焚|(zhì)等含大量酚羥基的物質(zhì)因不可逆吸附而不易回收［15］等問題使得黃酮提純工藝中的應(yīng)用相對(duì)較少，用其純化甜葉菊廢渣黃酮?jiǎng)t鮮有報(bào)道。本文采用殼聚糖絮凝劑先除去廢渣醇提物中的一些雜質(zhì)［16］，再用聚酰胺粉純化黃酮，并優(yōu)化了各階段的工藝條件，分析了聚酰胺吸附性能機(jī)理。解決了聚酰胺粉再生困難費(fèi)時(shí)的問題，使得工藝可連續(xù)過柱進(jìn)行，大大降低工藝成本，提升工藝的流暢性和效率，大幅提升黃酮純度。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，日本島津;BS223S型電子分析天平，德國Sartorius;85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，江蘇金壇市中大儀器廠;DHG-9140型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;A11基本型生物研磨機(jī)，德國IKA。

甜葉菊廢渣(江西省贛州市某公司)，蘆丁對(duì)照品(純度≥98%，貴州迪大科技有限責(zé)任公司)，聚酰胺粉(60～100目，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)，殼聚糖(上海伯奧生物科技有限公司，脫乙酰度≥90.0%)，無水乙醇、NaOH、Al(NO3)3、NaNO2等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取10.0 mg蘆丁對(duì)照品，體積分?jǐn)?shù)(下同)95%的乙醇溶解定容至 50 mL，分別取 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于50 mL 容量瓶，按 Al(NO3)3法顯色［17］，在500 nm處測定各自吸光度。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 甜葉菊廢渣醇提物的制備

按文獻(xiàn)條件提?。?8］，得到的固體溶于95%乙醇，按硝酸鋁法測定，得出提取物中黃酮純度為8.15%。稱取一定量提取物，用95%乙醇溶解，配成1.0 mg/mL的提取液。

1.2.3 殼聚糖純化條件的優(yōu)化

取0.1 g殼聚糖溶于100.0 mL體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液，配成0.1%的殼聚糖溶液。

每次取提取液50.0 mL于100 mL錐形瓶，分別改變殼聚糖溶液加入量，攪拌時(shí)間，絮凝溫度、pH值，靜置10 h，純化液在3 000 r/min下離心，過濾得濾液，95%乙醇補(bǔ)定至50 mL容量瓶，取5.0 mL測定黃酮濃度，余下45.0 mL液體80℃烘干稱重，黃酮純度計(jì)算:

式中:W為黃酮純度，%;c為測定黃酮濃度，mg/mL;V為待烘干液體體積，mL;m為烘干后得到的固體質(zhì)量，mg。

1.2.4 聚酰胺吸附和解吸性能

將聚酰胺粉放在95%乙醇中煮沸1 h，甩干，重復(fù)3次。取上述聚酰胺2.0 g于100 mL錐形瓶，加入0.5 mg/mL的初純液50.0 mL，25℃下恒溫?cái)嚢柚廖狡胶狻Ｈ?.0 mL測定黃酮濃度，計(jì)算吸附量和吸附率。

將上述吸附平衡的聚酰胺粉過濾并用蒸餾水洗滌甩干后，置于100 mL錐形瓶，加入95%的乙醇50.0 mL，25℃下恒溫?cái)嚢柚两馕胶?，?.0 mL測定，計(jì)算解吸率:

式中:Qe為平衡吸附量，mg/g;co為起始黃酮濃度，mg/mL;ce為吸附平衡時(shí)黃酮濃度，mg/mL;cd為解吸液黃酮濃度，mg/mL;Ve為平衡時(shí)溶液體積，mL;Vd為解吸液體積，mL;m為聚酰胺質(zhì)量，g;E為吸附率;D為解吸率。

1.2.5 吸附動(dòng)力學(xué)曲線及等溫線測定

取0.5 mg/mL的初純液按上述過程吸附，每隔20 min測定1次至吸附平衡，按(2)式計(jì)算吸附量，做時(shí)間與吸附量關(guān)系圖，并用Langmuir吸附速率方程擬合動(dòng)力學(xué)曲線。

分別取不同濃度提取液按上述過程吸附，測定吸附平衡時(shí)的濃度，按(3)式計(jì)算吸附率，做濃度與吸附率關(guān)系圖，用Langmuir方程和Freundhch方程擬合等溫線。

式中:ce、Qe同上;t為時(shí)間，min;Qt為t時(shí)刻吸附量，mg/g;Qmax為理論最大吸附量，mg/g;K、k、m、a皆為常數(shù)。

1.2.6 柱層析穿透曲線

采用濕法裝柱，將預(yù)處理過的聚酰胺粉裝入(10×400)mm玻璃層析柱，直至柱高25 cm，取0.5 mg/mL初純液以約1.0 mL/min的流速連續(xù)過柱，開始每10 min測定1次，以時(shí)間和吸光度為坐標(biāo)作穿透曲線。得到穿透點(diǎn)。

1.2.7 過柱吸附條件的優(yōu)化

將0.5 mg/mL的初純液以不同的流速過柱，至吸附平衡，測定黃酮濃度，按(3)式計(jì)算吸附率，作流速與吸附率的關(guān)系圖，得最佳流速。

取不同濃度的初純液分別在1.0 mL/min的流速下過柱，吸附至平衡，測定黃酮濃度，按(3)式計(jì)算吸附率，作黃酮濃度與吸附率的關(guān)系圖，得最佳上樣濃度。

1.2.8 過柱解吸條件的優(yōu)化

將吸附平衡后的聚酰胺柱用蒸餾水過柱洗至流出液幾乎無色，依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、無水乙醇在1.0 mL/min的流速下過柱洗脫，各收集約100 mL液體，直接紫外掃描得到200～600 nm的光譜圖，選取最佳的洗脫液濃度。

分別在不同流速下，用最佳濃度的乙醇洗脫，各收集100.0 mL液體，取5.0 mL測定，按(4)式計(jì)算解吸率。作流速與解吸率的關(guān)系圖，選取最佳流速。

1.2.9 聚酰胺柱再生性能實(shí)驗(yàn)

按上述過程及選定條件純化甜葉菊廢渣黃酮，收集100.0 mL純化液，取5.0 mL測定黃酮濃度，余下液體80℃烘干稱重，按(1)式計(jì)算黃酮純度。

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH在1.5 mL/min的流速下洗柱至流出液幾乎無色，再用體積相近的4%HCl在相同流速下洗柱，最后水洗至流出液接近中性，用得到的再生聚酰胺柱進(jìn)行純化，計(jì)算吸附率與純度。按相同過程及條件重復(fù)多次，作再生次數(shù)與黃酮吸附率、純度的關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。通過線性擬合得到吸光度和濃度的線性回歸方程:Y=13.42X+0.002，R2=0.999 5。濃度0.002～0.024 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 殼聚糖純化工藝條件初步優(yōu)選

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin calibration curve

按1.2.3步驟進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，各因素對(duì)黃酮純度的影響如表1所示。

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步得到合適的工藝條件如下:0.1%的殼聚糖乙酸溶液加入量為1.5 mL，攪拌時(shí)間為15 min，溫度為35℃，pH值為5。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of the single test

2.3 殼聚糖純化廢渣提取物正交實(shí)驗(yàn)

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以2.1條件為因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)(表1)，結(jié)果如表2、表3所示。

由表2極差可知，各因素影響程度順序pH＞溫度＞殼聚糖加入量＞攪拌時(shí)間，以極差最小值作為誤差項(xiàng)［20］，由表3可知，pH值對(duì)純度影響非常顯著，其他影響較小。綜合考慮，純化50 mL濃度為1.0 mg/mL的廢渣乙醇提取液的條件為攪拌時(shí)間15 min，溫度35℃，0.1%的殼聚糖溶液1.0 mL，pH值為5。按上述條件進(jìn)行多次驗(yàn)證，最終初純物平均純度為18.16%。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 L9(34)design of orthogonal experiment

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 result of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

2.4 聚酰胺層析柱進(jìn)一步純化黃酮

2.4.1 聚酰胺吸附解吸性能及等溫線曲線

吸附解吸率與黃酮濃度關(guān)系如圖6所示;吸附等溫線如圖7所示。將圖7數(shù)據(jù)代入(6)與(7)式，分別進(jìn)行擬合，得到Langmuir方程和Freundhch方程的線性擬合如圖8、圖9所示。

圖6 吸附解吸率與黃酮濃度關(guān)系Fig.6 The relationship between adsorption or desorption rate

由圖6可知，吸附率隨濃度上升而下降，故待純化黃酮濃度不宜過大。

由圖8得到Langmuir方程為ce=49.819ce/Qe-1.191，R2=0.997 8，線性關(guān)系良好，根據(jù)方程得到聚酰胺粉對(duì)黃酮最大吸附量的理論值為49.819 mg/g，該值越大表明吸附劑越容易吸附黃酮，結(jié)果非?？捎^。

圖7 吸附等溫曲線Fig.7 Adsorption isothermal curve and concentration

圖8 Langmuir方程線性擬合圖Fig.8 Linear fitting of Langmuir equation

由圖9得到Freundhch方程為ln(Qe)=0.393ln(ce)+1.978，R2=0.999 5，線性關(guān)系良好根據(jù)方程得到系數(shù)1/n為0.393，在0.1～0.5之間，表明聚酰胺粉容易吸附黃酮［21］。

由結(jié)果得知，2種模型都能較好地模擬聚酰胺吸附性能。Langmuir模型表征單分子層吸附，而Freundlich模型覆蓋范圍更大。根據(jù)R2值可知，后者能更好地描述吸附性能。故認(rèn)為聚酰胺粉對(duì)甜葉菊廢渣黃酮的吸附屬于中等程度覆蓋率的單分子層吸附［22］。

2.3.2 聚酰胺吸附動(dòng)力學(xué)

吸附量與吸附時(shí)間的關(guān)系如圖10所示。大約在2h達(dá)到平衡。選取圖10中前5個(gè)數(shù)據(jù)，按(5)式計(jì)算，進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)線性擬合，如圖11所示。擬合得到方程為:ln［Qe/(Qe-Qt)］=0.046 9t-0.620，R2=0.997，線性關(guān)系良好。2 h內(nèi)吸附達(dá)到平衡且線性關(guān)系良好的吸附劑屬于快速吸附型［23］。

2.3.3 柱層析穿透曲線

穿透曲線如圖12所示。約40 min，即流出40 mL液體后，吸光度明顯大于零，即開始有黃酮流出，此為穿透點(diǎn)，吸附已開始達(dá)到飽和。此時(shí)濃度為0.017 5 mg/mL，原液黃酮濃度為0.103 mg/mL，吸附率83.01%。為確保聚酰胺完全吸附飽和，實(shí)際過柱液體應(yīng)略微過量。本實(shí)驗(yàn)確定過柱液體體積50 mL。

圖9 Freundhch方程線性擬合圖Fig.9 Linear fitting of Freundhch equation

圖10 吸附量與時(shí)間的關(guān)系Fig.10 The relationship between adsorption quantity and time

圖11 吸附動(dòng)力學(xué)方程線性擬合曲Fig.11 Linear fitting of adsorption kinetics equation

2.3.4 上樣濃度及流速的選擇

上樣濃度及流速分別對(duì)應(yīng)吸附率關(guān)系見圖13、圖14。吸附率隨樣液濃度及流速的增加大致呈下降趨勢，故選取黃酮濃度約為0.2 mg/mL，流速為1.5 mL/min。

2.3.5 乙醇洗脫濃度的選擇

各濃度乙醇與對(duì)應(yīng)洗脫物的紫外光譜如圖15～圖18。大多數(shù)黃酮由于苯甲?；凸鹌；w系的電子躍遷在240～285 nm和300～400 nm都有吸收峰［19］。由圖15～圖18可知，60%乙醇洗脫能明顯檢測到黃酮類物質(zhì)。30%、40%乙醇洗脫物210 nm處的吸收峰可能為溶劑峰，50%乙醇洗脫物的峰值不明顯，70%以上乙醇洗脫物在510 nm和410 nm處的吸收峰可能為雜質(zhì)峰。故洗脫乙醇濃度為60%。

圖12 吸附穿透曲線Fig.12 Adsorption breakthrough curve

圖13 上樣濃度與吸附率關(guān)系Fig.13 The relationship between sample concentration and adsorption rate

圖14 流速與吸附率的關(guān)系Fig.14 The relationship between velocity and adsorption rate

圖15 10%、20%乙醇洗脫物紫外光譜Fig.15 10%and 20%Ethanol elution ultraviolet spectrum

2.3.6 洗脫速度的選擇

洗脫速度與解吸率的關(guān)系見圖19。流速大于1.5 mL/min時(shí)解吸率開始下降，故選1.5 mL/min較為合適。

2.3.7 聚酰胺再生性能的測定

圖16 30%、40%乙醇洗脫物紫外光譜Fig.16 30%and 40%Ethanol elution ultraviolet spectrum

圖17 50%、60%乙醇洗脫物紫外光譜Fig.17 50%and 60%Ethanol elution ultraviolet spectrum

圖18 70%、80%、90%、無水乙醇洗脫物紫外光譜Fig.18 70%，80%，90%and absolute ethanol elution ultraviolet spectrum

圖19 解吸率與洗脫速度的關(guān)系圖Fig.19 The relationship between desorption rate and velocity

用濃度約為0.2 mg/mL的黃酮液約50 mL上柱，吸附流速為1.5 mL/min，洗脫液為60%的乙醇，解吸流速為1.5 mL/min，洗脫至無色(需約100 mL洗脫液)。計(jì)算得到黃酮平均純度為53.42%。

再生聚酰胺柱時(shí)使用的酸堿量分別都約為200 mL，用該柱按上述條件純化，重復(fù)多次。再生次數(shù)與吸附率、黃酮純度的關(guān)系如圖20、圖21所示。重復(fù)使用6次使得聚酰胺的性能似乎略有下降，但吸附率和黃酮純度仍保持在70%和50%以上。故認(rèn)為至少可連續(xù)再生6次。

圖20 再生次數(shù)與吸附率關(guān)系Fig.20 The relationship between regeneration times and absorption rate

圖21 再生次數(shù)與黃酮純度關(guān)系Fig.21 The relationship between regeneration times and absorption rate

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖絮凝與聚酰胺吸附相結(jié)合的方法純化甜葉菊廢渣乙醇提取液中的黃酮。先以黃酮純度為主要指標(biāo)，考察了多個(gè)殼聚糖絮凝的影響因素，通過正交分析，優(yōu)化殼聚糖絮凝沉淀法的純化條件:在1.0 mg/mL提取物中加入0.1%殼聚糖溶液1.0 mL，殼聚糖絮凝溫度35℃，pH=5，攪拌時(shí)間15 min;分析了聚酰胺粉對(duì)甜葉菊廢渣黃酮的吸附解吸性能、吸附動(dòng)力學(xué)及等溫線，優(yōu)化了聚酰胺純化法的工藝條件:上樣濃度為0.2 mg/mL，流速為1.5 mL/min，洗脫液為60%乙醇，流速為1.5 mL/min，黃酮純度達(dá)到53.42%，結(jié)果非?？捎^，達(dá)到一些工業(yè)產(chǎn)品的純度需求。

該工藝解決了聚酰胺再生困難的問題，且殼聚糖本身投入量極低，大大降低了成本。再生過程無需長時(shí)間浸泡，而以洗脫的方式進(jìn)行，大大提高工藝連續(xù)性和效率，易于操作，可用于純化甜葉菊廢渣黃酮。

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