硒、鋅元素對(duì)羊肚菌多糖抗氧化性的影響*

黃玲玲，蘇彩霞，張宗申，金朝霞

1(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連，116034)2(大連漢信生物制藥有限公司，遼寧大連，116034)

羊肚菌是一種名貴的大型食藥兼用真菌，羊肚菌多糖是其主要的活性有效成分之一［1］，具有抗腫瘤、降凝血、延緩衰老、提高機(jī)體免疫力等多種功效［1-3］，被應(yīng)用到醫(yī)藥、食品和發(fā)酵等領(lǐng)域［2］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)羊肚菌的研究主要關(guān)注于其發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化及對(duì)多糖提取方法的研究［3-4］，對(duì)羊肚菌多糖抗氧化性能，及羊肚菌對(duì)Se、Zn等微量元素富集后生物活性的研究相對(duì)較少。

Se、Zn均為人體必需的微量元素［5］。為了研究Se、Zn元素對(duì)羊肚菌多糖抗氧化活性的影響，本實(shí)驗(yàn)以亞硒酸鈉(Na2SeO3)和硫酸鋅(ZnSO4)的形式添加Se、Zn元素后，對(duì)羊肚菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲體胞內(nèi)多糖經(jīng)分離提取后，測(cè)定其抗氧化活性［6］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

羊肚菌(Morchella esculenta)，大連工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

主要試劑:體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，濃 H2SO4，水楊酸，鄰苯三酚，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，30%H2O2，K4Fe(CN)6，抗壞血酸等均為分析純?cè)噭?/p>

主要儀器:紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;超聲脫氣機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司等。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基［7］:蔗糖 30 g，蛋白胨 1 g，酵母膏 5 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基［8］:蔗糖 40 g，酵母膏 5 g，NH4NO33 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7 H2O 1.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 5.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胞內(nèi)多糖的制備

取干燥的羊肚菌菌絲體進(jìn)行研磨粉碎，用超聲波兼熱水浸提提取多糖(400 W，60℃超聲40 min，60℃熱水浸提5 h)，對(duì)浸提液進(jìn)行醇沉提取(加入3倍體積85%的乙醇充分?jǐn)嚢韬?，?℃下靜置24 h，3 000 r/min離心棄去上清液，沉淀用60℃水溶解)［9］。

乙醇提取獲得的多糖經(jīng)Sevage法［10］除蛋白，獲得粗多糖(IPS)。

1.2.2 多糖濃度的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法和DNS法分別測(cè)定總糖和還原糖的濃度，多糖濃度為兩數(shù)值之差［12］。

1.2.3 Se、Zn離子濃度的確定

分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Na2SeO3和ZnSO4(其他成分保持不變)［11］，使Se、Zn離子的最終質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5 g/L，測(cè)定胞內(nèi)多糖(IPS)得率和菌絲體干重(CDW)2項(xiàng)指標(biāo)選擇合適的硒、鋅離子添加質(zhì)量濃度。

1.3 多糖抗氧化性的研究

以抗壞血酸(VC)作對(duì)照，對(duì)多糖進(jìn)行體外抗氧化活性研究。

1.3.1 總還原力的測(cè)定

K4Fe(CN)6法測(cè)定羊肚菌多糖的還原力［13-14］。將粗多糖稀釋成不同濃度梯度的樣品，每1 mL多糖樣品中加入0.2 mol/L pH 6.6的H3PO4緩沖液和1%K4Fe(CN)6溶液各2.0 mL，混合均勻，于50℃保溫20 min后，加入1.0 mL 10% 的三氯乙酸，混勻后3 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，加1 mL 0.1%FeCl3，充分混合，加蒸餾水定容至7 mL，靜置10 min后于700 nm處測(cè)定吸光度，吸光度值越大，表明還原力越高。

1.3.2 多糖對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)清除率的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法［16］。取 4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，25℃水浴中預(yù)熱20 min，加入0.1 mL各樣品液，2.5 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，混勻后在25℃的水浴中反應(yīng)6 min，立即加入0.1 mL 8 mol/L的HCl終止反應(yīng)，并在320 nm處測(cè)定吸光值(以蒸餾水調(diào)零)，清除率計(jì)算:

式(1):AX代表樣品液和鄰苯三酚均加入的溶液吸光值;AX0表示不加鄰苯三酚的樣品吸光值;A0為不加樣品加入鄰苯三酚的溶液吸光值。

1.3.3 多糖對(duì)羥基自由基(·OH)清除率的測(cè)定

采用 Fenton體系［15-16］，該體系包括 16 mmol/L H2O21 mL、18 mmol/L FeSO41 mL、18 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL和不同濃度的樣品溶液1 mL。最后加入H2O2在37℃下啟動(dòng)反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為參比，在510 nm下測(cè)定各溶液的吸光度(VC作對(duì)照)?！H清除率:

公式中:A0表示不加樣品，加入H2O2顯色劑的溶液吸光度;Ax為加入樣品溶液和H2O2顯色劑的溶液吸光度，Ax0為不加顯色劑H2O2的樣品溶液本底的吸光度值。

2 結(jié)果及討論

2.1 Se、Zn元素添加量的選擇

2.1.1 Se元素添加量的選擇

Na2SeO3的添加在一定濃度范圍內(nèi)會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，但濃度過(guò)高，會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，如圖1所示，當(dāng)Se元素添加的最終質(zhì)量濃度為0.2 g/L時(shí)，菌絲體干重為(15.75±3.14)g/L，硒多糖(IPS-Se)得率也處于最高水平，為(16.05±0.65)mg/g，此時(shí)羊肚菌多糖的還原力吸光值為0.95±0.004，達(dá)到最高?？紤]到菌體的生長(zhǎng)量、多糖得率及還原力等因素，Se元素的適宜添加質(zhì)量濃度為0.2 g/L。

圖1 Se濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)量、多糖得率和總還原力的影響Fig.1 Effect of selenium concentration on cell growth，polysaccharide yield and reducing power

2.1.2 鋅元素添加量的選擇

如圖2所示，當(dāng)硫酸鋅的添加質(zhì)量濃度為0.15 g/L時(shí)，菌絲體干重達(dá)到最高(16.21±2.31)g/L，多糖得率為(10.21±2.01)mg/g，總還原力為0.95±0.009，達(dá)到最高。由此可以看出，以ZnSO4的形式加入鋅元素在菌體生長(zhǎng)良好的條件下，為獲得較高的多糖得率及較好的抗氧化活性，選擇的適宜濃度為0.15 g/L。

圖2 Zn濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)量、多糖得率和還原力的影響Fig.2 Effect of zinc concentration on cell growth，polysaccharide yield and reducing power

2.2 Se、Zn元素的添加對(duì)胞內(nèi)多糖抗氧化性的影響

2.2.1 Se、Zn的添加對(duì)多糖還原力的影響

由圖3可以看出，多糖和VC均具有較高的還原力，且隨濃度的增加表現(xiàn)出良好的濃度相關(guān)性［9］。當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，Se多糖的還原力為0.979±0.632，近似于同濃度的 VC(0.981±0.052)，鋅多糖的還原力為0.821±0.302，是同濃度VC的4/5，普通多糖則相對(duì)較低，為0.710±0.132。

圖3 多糖和VC的還原力比較Fig.3 The reducing power of EPS and VC

2.2.2 硒、鋅的添加對(duì)多糖清除超氧陰離子自由基(O2-·)效果的影響

多糖對(duì)O2-·的清除能力與多糖濃度之間存在明顯的量效關(guān)系［9］(圖4)。

圖4 多糖和VC對(duì)O2-·的清除能力比較Fig.4 The scavenging ability of EPS and VC on O2-·

當(dāng)樣品的濃度＜1 mg/mL時(shí)，其對(duì)O2-·清除率的大小為VC＞IPS-Se＞IPS-Zn＞IPS，當(dāng)濃度＞1 mg/mL時(shí)，清除率為VC≈IPS-Se＞IPS-Zn＞IPS?？梢钥闯?，Se、Zn元素的添加，使羊肚菌多糖對(duì)O2-·的清除作用明顯增強(qiáng)，且隨濃度的增加，IPS-Se可以達(dá)到與VC相同的清除效果。

IC50為清除率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度，其大小可作為判斷抗氧化活性強(qiáng)弱的一項(xiàng)指標(biāo)，圖4所示，經(jīng)過(guò)分析計(jì)算得出，VC、IPS、IPS-Zn、IPS-Se 清除50%的O2-·時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度分別為(0.19±0.09)、(3.23±0.25)、(0.84±0.56)、(0.55±0.23)mg/mL，結(jié)果表明Zn、Se元素的添加，提升了胞內(nèi)多糖的抗氧化活性，硒多糖抗氧化活性是普通胞內(nèi)多糖的6倍，鋅多糖為普通胞內(nèi)多糖的4倍。

2.2.3 Se、Zn的添加對(duì)多糖清除羥基自由基(·OH)效果的影響

根據(jù)圖5 分析 IC50值，結(jié)果為 VC、IPS-Se、IPS-Zn、IPS對(duì)·OH的清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度分別為(1.39 ±0.56)、(2.01 ±1.23)、(4.23 ±1.25)、(4.45±0.95)mg/mL，Se的添加使羊肚菌胞內(nèi)多糖對(duì)·OH的清除能力提高了2倍，是同濃度VC清除能力的1/2;但是Zn離子的添加，使羊肚菌多糖對(duì)·OH的清除作用不明顯。圖5中，當(dāng)樣品濃度為5 mg/mL時(shí)，IPS-Se、IPS-Zn、IPS對(duì)·OH的清除率分別為(65.21±5.62)%、(60.03±3.25)%、(56.03±5.23)%，鋅多糖對(duì)·OH的清除率較普通多糖增加了4%。

圖4和圖5及IC50的數(shù)據(jù)分析說(shuō)明:Se元素的添加增強(qiáng)了多糖的抗氧化性，而Zn元素的添加，總體增強(qiáng)效果不明顯，但對(duì)O2-·的清除率提高了3～4倍(ρ IPS(IC50)/(mg·mL-1)=3.23±0.25;ρ IPS-Zn(IC50)/(mg·mL-1)=0.84±0.56。

圖5 多糖和VC對(duì)·OH的清除能力比較Fig.5 The scavenging ability of EPS and VCon·OH

3 結(jié)論

本研究在進(jìn)行羊肚菌的液體培養(yǎng)時(shí)添加適量的Na2SeO3和ZnSO4，使無(wú)機(jī)態(tài)的Se、Zn元素得到生物富集，形成有機(jī)態(tài)的復(fù)合物，提高了硒、鋅微量元素的穩(wěn)定性，有利于人體的吸收利用，同時(shí)在不影響菌體生長(zhǎng)的前提下，提高了羊肚菌多糖的抗氧化活性。

該研究通過(guò)單因素方法對(duì)Se、Zn離子的添加質(zhì)量濃度進(jìn)行選擇，確定了Na2SeO3的最適添加質(zhì)量濃度為0.2 g/L，與孟凡云［17］在2010年對(duì)無(wú)機(jī)Se添加量的研究結(jié)果一致;ZnSO4的最適添加濃度為0.15 g/L，與Zhang［6］等研究無(wú)機(jī)Zn添加量的選擇相似。

羊肚菌多糖的體外抗氧化活性研究表明，Se、Zn微量元素的添加使多糖的抗氧化活性得到了提高，當(dāng)多糖濃度為3 mg/mL時(shí)對(duì)O2-·的清除率與同濃度VC相同，這一點(diǎn)在其他食用菌對(duì)微量元素的生物富集中也有同樣的效果［18］。

研究中發(fā)現(xiàn)，羊肚菌多糖對(duì)O2-·的清除效果普遍高于對(duì)·OH的清除效果，當(dāng)樣品濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì) O2-·的清除率可達(dá)到98%(IPS-Se)，對(duì)·OH的清除率僅為30%左右(IPS-Se)，這可能是由于羥基之間易形成氫鍵，使較大分子質(zhì)量的多糖溶解性降低，故而對(duì)·OH的清除率降低［19］。

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