鼠李糖乳桿菌乳飲料發(fā)酵工藝*

張明，代青梅，任發(fā)政，楊子彪，趙亮

1(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京，100048)

2(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

3(大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程與經(jīng)管系，云南大理，671003)1

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnose)是國(guó)家認(rèn)可的第3代益生菌的一種，可以黏附于腸道上皮細(xì)胞并定殖于人體［1-5］，可提高人體免疫能力［6-7］，緩解腸道疾?。?-9］，消減體內(nèi)毒素［10］;抑制，殺死有害菌等生理功能［11］。然而，目前市場(chǎng)上的鼠李糖乳桿菌產(chǎn)品多數(shù)為直接將益生菌直接添加，在產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中鼠李糖乳桿菌沒(méi)有增殖，成本高。本文對(duì)鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵條件和工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以便進(jìn)一步研究大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)工藝，為菌株的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103)，維利奧公司提供。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖 20 g，CH3COONa 5 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào) pH 至6.2～6.4。

1.2 儀器

Delta-320型 pH計(jì)，瑞士 Mettler Toledo公司;DHG-9240A型熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;MIR-162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司;APV1000高壓均質(zhì)機(jī)，德國(guó)APV公司;HVA-110型滅菌器，日本Hirayama公司;VIS-7220型分光光度計(jì)，北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司;3K3O高速離心機(jī)，德國(guó)Sartorius公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵乳飲料基本工藝流程

發(fā)酵劑制備:配制并殺菌MRS液體培養(yǎng)基接種鼠李糖乳桿菌，37℃培養(yǎng)活化1～3次，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期收獲菌體，按照2×107CFU/mL分別接種于無(wú)菌葡萄糖脫脂乳(脫脂奶粉、葡萄糖和蒸餾水質(zhì)量比為12∶3∶85)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)活化若干次，當(dāng)凝乳時(shí)間達(dá)到穩(wěn)定后完成菌種活化。

發(fā)酵乳制作工藝流程:將脫脂奶粉、葡萄糖和蒸餾水以12∶3∶85的質(zhì)量比混合后，經(jīng)過(guò)預(yù)熱、均質(zhì)、殺菌、冷卻4個(gè)步驟后以3%的接種量接種L.rhamnose，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間發(fā)酵破乳后進(jìn)行第2次均質(zhì)制得發(fā)酵乳。

乳酸菌飲料二次配料工藝流程:按發(fā)酵乳與白砂糖溶液(經(jīng)殺菌的白砂糖溶液，濃度16%)質(zhì)量比為3∶7混合均勻，定容后進(jìn)行第3次均質(zhì)，制成發(fā)酵乳飲料成品

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

沉淀率:在50 mL離心管中準(zhǔn)確加入一定量的發(fā)酵乳飲料成品，845 g離心10 min，去除上層清液，準(zhǔn)確稱取沉淀物的質(zhì)量(g)，計(jì)算沉淀率，作為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵乳飲料的穩(wěn)定性的評(píng)判指標(biāo)。

1.3.3 鼠李糖乳桿菌對(duì)碳源的利用

將不同碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖)以脫脂奶粉、碳源、蒸餾水=12∶3∶85的比例混合后，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，分別在2，4，8，12，16，20和24 h測(cè)定其OD值，測(cè)定該菌對(duì)各碳源的利用情況并繪制OD值變化曲線。

1.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵過(guò)程及產(chǎn)品品質(zhì)的影響

根據(jù)2.3.1發(fā)酵乳飲料基本工藝流程，12%脫脂乳粉還原乳，添加3%的葡萄糖，105℃，45 min殺菌，冷卻至37℃接種3%，37℃恒溫水浴發(fā)酵120 h，從接種開(kāi)始計(jì)時(shí)，每24 h取樣測(cè)定發(fā)酵乳乳酸菌活菌數(shù)，同時(shí)按照2.3.1發(fā)酵乳飲料工藝流程進(jìn)行乳飲料二次配料并測(cè)定其沉淀率。

1.3.5 殺菌條件對(duì)發(fā)酵過(guò)程及產(chǎn)品品質(zhì)的影響

根據(jù)2.3.1發(fā)酵乳制作工藝流程，12%脫脂乳粉還原乳，添加3%的葡萄糖，選擇殺菌條件分別為95℃ /60 min，105 ℃/45 min，115 ℃ /15 min殺菌，冷卻至37℃接種3%，37℃恒溫水浴發(fā)酵72 h終止發(fā)酵并測(cè)定發(fā)酵乳乳酸菌活菌數(shù)，同時(shí)按照2.3.1發(fā)酵乳飲料工藝流程進(jìn)行乳飲料二次配料并測(cè)定其沉淀率。

1.3.6 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程及產(chǎn)品品質(zhì)的影響

根據(jù)2.3.1發(fā)酵乳制作工藝流程，12%脫脂乳粉還原乳，添加3%的葡萄糖，105℃殺菌45 min，冷卻至35℃，37℃和42℃后，接種3%的鼠李糖乳桿菌，分別在35℃，37℃和42℃恒溫水浴發(fā)酵72 h終止發(fā)酵并測(cè)定發(fā)酵乳乳酸菌活菌數(shù)，同時(shí)按照2.3.1發(fā)酵乳飲料工藝流程進(jìn)行乳飲料二次配料并測(cè)定其沉淀率。

1.3.7 發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)

分析發(fā)酵時(shí)間、殺菌條件、發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌活菌數(shù)、乳飲料的沉淀率的影響和白砂糖濃度對(duì)乳飲料的沉淀率的影響結(jié)果，對(duì)發(fā)酵時(shí)間，殺菌條件以及發(fā)酵溫度進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析方法

首先每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果利用SPSS分析軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan，s multiple test方法進(jìn)行比較分析。a，b，c不同字母表示個(gè)處理組之間差異顯著，相同字母則表示無(wú)顯著性差異(顯著性水平P=0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鼠李糖乳桿菌對(duì)碳源的選擇

圖1為L(zhǎng).rhamnose在不同碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線?？梢钥闯?，L.rhamnose在葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度最快，發(fā)酵24 h后，L.rhamnose在葡萄糖、果糖、半乳糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異。L.rhamnose在葡萄糖、果糖、半乳糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的速度顯著高于乳糖、蔗糖和麥芽糖，這可能是由于L.rhamnose對(duì)單糖的利用效率相對(duì)較高，而對(duì)多糖的代謝是及其微弱的。出于生產(chǎn)成本的考慮，本研究在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇發(fā)酵快、價(jià)格低的葡萄糖作為培養(yǎng)基中的碳源。

圖1 不同碳源對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the growth of L.rhamnose

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)和產(chǎn)品沉淀率影響

圖2是鼠李糖乳桿菌發(fā)酵120 h的過(guò)程中，發(fā)酵24，48，72，96 和 120 h 時(shí)發(fā)酵液的 L.rhamnose活菌數(shù)和二次配料后乳飲料的沉淀率情況對(duì)比結(jié)果。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)及沉淀率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the viable count and precipitation rate

從圖2A可以看出，24～48 h，乳酸菌活菌數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，48～120 h的發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌活菌數(shù)呈降低趨勢(shì)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析顯示發(fā)酵24 h時(shí)乳酸菌活菌數(shù)顯著低于其他各取樣點(diǎn)乳酸菌活菌數(shù)(P＜0.05)，48 h后各取樣點(diǎn)的發(fā)酵乳中L.rhamnose活菌數(shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

從圖2B 可以看出，若以 24，48，72，96和 120 h分別為發(fā)酵終點(diǎn)進(jìn)行二次配料，乳飲料的沉淀率隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)沉淀率呈降低趨勢(shì)。72，96和120 h二次配料的乳飲料沉淀率顯著低于24和48 h(P＜0.05)，72 h，96 h和120 h無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)，發(fā)酵后期沉淀率降低分析原因可能在酸乳發(fā)酵后期，乳酸菌釋放出的蛋白酶進(jìn)一步降解蛋白質(zhì)生成小肽和氨基酸，降低了沉淀率;另一方面，發(fā)酵后期乳酸菌產(chǎn)酸，依靠電荷的排斥力使體系保持分散狀態(tài)［12］。

綜合發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌活菌數(shù)及乳飲料的沉淀率，選擇發(fā)酵72 h時(shí)作為發(fā)酵終點(diǎn)。72 h終止發(fā)酵時(shí)即可以得到乳酸菌活菌數(shù)大于1×108CFU/mL，沉淀率低乳飲料。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)活菌數(shù)和產(chǎn)品沉淀率影響

圖3為發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌活菌數(shù)和乳飲料沉淀率的結(jié)果。從圖3A可以看出，35和37℃發(fā)酵對(duì)乳酸菌活菌數(shù)無(wú)顯著性影響(P＞0.05)，二者均顯著高于42℃發(fā)酵的L.rhamnose活菌數(shù)(P＜0.05);從圖3B可以看出分別在37，42和35℃發(fā)酵72 h進(jìn)行二次配料，乳飲料沉淀率依次升高，差異顯著(P＜0.05)。本試驗(yàn)中乳酸菌活菌數(shù)越高越好，沉淀率越低越好，所以綜合分析，發(fā)酵溫度選擇37℃。

2.4 殺菌條件對(duì)活菌數(shù)及產(chǎn)品沉淀率的影響

由單一鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳飲料的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，在發(fā)酵過(guò)程中易引起雜菌污染的現(xiàn)象，因此對(duì)原料乳進(jìn)行徹底的殺菌尤其重要，本研究選用了3種不同的殺菌條件，95℃/60 min、105℃/45 min和115℃/15 min，通過(guò)比較3種殺菌條件的顏色可知，95℃/60 min殺菌從色澤淺，不可以接受，而105℃/45 min和115℃/15 min殺菌從色澤上可以接受。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)活菌數(shù)和產(chǎn)品沉淀率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the viable count and precipitation rate

圖4 殺菌條件對(duì)活菌數(shù)及產(chǎn)品沉淀率的影響Fig.4 Effect of sterilizing condition on the viable count and precipitation rate

殺菌條件對(duì)L.rhamnose活菌數(shù)及產(chǎn)品沉淀率的影響如圖4所示。經(jīng)3種殺菌條件處理的樣品L.rhamnose菌活菌數(shù)有顯著性差異，115℃/15 min殺菌處理后，L.rhamnose發(fā)酵終點(diǎn)的活菌數(shù)顯著高于其他兩種殺菌條件(P＜0.05)。這可能由于乳酸菌對(duì)葡萄糖和脫脂乳不同熱處理?xiàng)l件下產(chǎn)物的利用效率不同導(dǎo)致的。而不同殺菌條件下，產(chǎn)品的沉淀率也有明顯的差別，95℃/60 min處理，產(chǎn)品的沉淀率達(dá)到8.3%，顯著高于其他兩種殺菌條件(P＜0.05)，105℃/45 min處理后產(chǎn)品的沉淀率也優(yōu)于115℃/15 min處理。這可能是由于殺菌過(guò)程中，熱處理強(qiáng)度不同，乳中成分發(fā)生了不同的變化:尤其是加熱過(guò)程中可能導(dǎo)致pH下降、美拉德反應(yīng)褐變反應(yīng)，以及蛋白質(zhì)的各種變性以及相互間的反應(yīng)，加熱處理強(qiáng)度不同，使得乳酸菌對(duì)蛋白的降解程度不同，蛋白水解物的數(shù)量影響其溶解性。根據(jù) Graveland-Bikker等的研究結(jié)果［13］，為了提高產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度和減少乳清析出通常采用在對(duì)牛乳酸化前先進(jìn)行熱處理，進(jìn)而影響其穩(wěn)定性。本試驗(yàn)中，乳酸菌活菌數(shù)越高越好，沉淀率越低越好，所以綜合分析綜合優(yōu)先選擇115℃/15 min的殺菌條件。

2.5 發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵工藝對(duì)沉淀率的影響較大，而對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)的影響不大，發(fā)酵72 h后，均大于1×109CFU/mL。因此，本研究以沉淀率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在其他工藝條件一定的條件下，選取以A發(fā)酵時(shí)間，B殺菌條件，C發(fā)酵溫度，進(jìn)行了3因素3水平的正交試驗(yàn)(如表2)。

表1 正交試驗(yàn)因素表Table 1 Factors and levels for L9(33)orthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9(33)orthogonal array design and results

表3和表4為正交試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果。從表3和表4可以得出，影響乳飲料的沉淀率的因素由主到次依次為:A﹥C﹥B，由于本試驗(yàn)中沉淀率越低，產(chǎn)品的穩(wěn)定性越好，所以極差分析及方差分析得出的最佳水平為:A3B2C2，即發(fā)酵時(shí)間84 h，殺菌條件115℃，15 min，發(fā)酵溫度為37℃。

2.6 貯藏穩(wěn)定性

對(duì)單因素及正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證并進(jìn)行貯藏穩(wěn)定性研究。制得乳酸菌活菌數(shù)為8.5×108CFU/mL，沉淀率為1.1%。4℃冷藏的條件下產(chǎn)品中乳酸菌活菌數(shù)和沉淀率變化曲線如圖5所示。從圖5可以看出乳酸菌活菌數(shù)和沉淀率在冷藏期間均未發(fā)生顯著性變化。沉淀率在貯藏期后期升高，但沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，儲(chǔ)藏杯底部有少量的沉淀出現(xiàn)，但無(wú)明顯的分層現(xiàn)象。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of L9(33)orthogonal array design

圖5 貯藏期內(nèi)乳酸菌活菌數(shù)和沉淀率的變化Fig.5 Effect of storage time on the viable count and precipitation rate

3 結(jié)論

通過(guò)研究鼠李糖乳桿菌對(duì)6種不同碳源的發(fā)酵特性，篩選出葡萄糖作為菌株的最適碳源。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定工藝參數(shù)為:殺菌條件為115℃/15 min，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時(shí)間為84 h，按照乳飲料工藝制乳酸菌活菌數(shù)為8.5×108CFU/mL，沉淀率為1.1%的鼠李糖乳桿菌發(fā)酵乳飲料。貯藏期內(nèi)乳酸菌活菌數(shù)無(wú)顯著性變化，貯藏期內(nèi)無(wú)明顯的分層及有極少量的沉淀出現(xiàn)，沉淀率無(wú)顯著性變化。

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