低強(qiáng)度微波處理對獼猴桃細(xì)胞壁降解酶活性的影響

李明霞，韓建群，王琦，何雨婷，郭艷明，董明，2

1(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥，230036)

2(合肥市農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽 合肥，230036)

獼猴桃(Actinidia chinensis)屬于獼猴桃科獼猴桃屬多年生落葉藤本植物，果肉質(zhì)地細(xì)嫩，氣味清香，酸甜可口，且具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。近年來，獼猴桃產(chǎn)量逐年提高，但是獼猴桃果實不耐貯運(yùn)，易于軟化腐爛，從而制約市場的銷售和生產(chǎn)發(fā)展。果肉軟化是獼猴桃成熟衰老的主要特征之一，防止果實軟化可延長水果的壽命和貨架期。獼猴桃果實軟化的原因是細(xì)胞壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，通過細(xì)胞壁物質(zhì)的降解作用引起［1-2］，與細(xì)胞壁降解有關(guān)的酶主要是多聚半乳糖醛酸酶［3-5］、果膠甲酯酶［6-7］、纖維素酶［8］和β-半乳糖苷酶［9］等。

近年來，微波在食品加工方面的應(yīng)用，主要是利用微波激發(fā)水分子的運(yùn)動產(chǎn)生的熱效應(yīng)來體現(xiàn)的，可用于食品加熱或殺菌［10］，同時微波存在的非熱效應(yīng)未能引起足夠的重視，相關(guān)研究甚少。微波的非熱效應(yīng)是指微波作用對溫度沒有明顯變化的情況下，對生物體產(chǎn)生的影響。有研究表明，弱微波照射可使生物體的理化性質(zhì)，功能特性發(fā)生變化［11］，使其生理活性物質(zhì)發(fā)生變異而喪失活力或死亡［12］。同時，微波的電場會使細(xì)胞的膜功能發(fā)生變異，從而使細(xì)胞的正常代謝功能及生理功能受到相應(yīng)的破壞，這樣可以使微生物的生長受到抑制或死亡［13］，進(jìn)而使細(xì)胞的DNA和RNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但是微波的非熱生物效應(yīng)在果蔬保鮮方面研究報道甚少，目前僅有戴美娟等［14］、費(fèi)莉娟等［15］對獼猴桃、草莓開展微波保鮮的相關(guān)研究報道。

本試驗通過研究低強(qiáng)度微波處理獼猴桃果實在其貯存過程中的細(xì)胞壁降解相關(guān)酶——多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲酯酶(PME)、纖維酶(Cx)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性的變化，結(jié)合果實品質(zhì)指標(biāo)分析，初步探討了低強(qiáng)度微波對獼猴桃果實軟化和保鮮的影響，為進(jìn)一步開發(fā)安全、簡便、快捷的果實貯藏保鮮新技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品處理

1.1.1 試驗材料

供試獼猴桃品種為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的“皖翠”獼猴桃果實，于2014年10月20日采自安徽省霍邱縣皖西獼猴桃研究所。采收當(dāng)日運(yùn)回農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏實驗室，在0～1℃的冷庫預(yù)冷10 h左右。挑選表面保持完好，無機(jī)械損傷，無病蟲害，無腐爛，大小、成熟度一致的獼猴桃果實作為樣品。

1.1.2 樣品處理

將預(yù)冷獼猴桃分11組進(jìn)行微波連續(xù)照射處理，微波輸出功率為32.5 W 時，設(shè)置 3、5、7、9、11 min;65 W時設(shè)置2、3、4、5、6 min，另設(shè)對照 1 組。每組微波處理前后實測果心溫度，處理后在常溫下放置2 h后，用PE保鮮袋包裝裝箱，轉(zhuǎn)入0～1℃的冷庫中貯藏，每15天隨機(jī)取樣1次進(jìn)行各項指標(biāo)的測定，重復(fù)3次。

1.2 儀器與設(shè)備

SAM-255型微波系統(tǒng)，美國CEM公司;LR20-A高速冷凍離心機(jī)，北京雷勃爾冷凍離心機(jī)有限公司;PHB-4雷磁牌數(shù)字型pH計，上海精密雷磁公司;UV-5800PC型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司;GY-4數(shù)顯臺式水果硬度計，浙江托普儀器有限公司。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 品質(zhì)指標(biāo)的測定

可溶性糖含量采用硫酸蒽酮試劑法;可滴定酸含量采用酸堿滴定法;Vc含量的測定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法。

1.3.2 果肉硬度的測定

用GY-4數(shù)顯式水果硬度計測定其果實的硬度，每個處理隨機(jī)取8個果實，單個果實從不同的部位測4次，測定時削去果皮的面積為1 cm2，取平均值。

1.3.3 細(xì)胞壁酶活性的測定

酶液的提取參考 Lohani等［16］和 Deng 等［17］的方法進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)，取果肉組織4 g，樣品放于冷凍過的研缽，將研缽放于碎冰上，加入40 mL，50 mmol/L pH 7的 Tris-HCl緩沖液(含有 20 mol/L NaCl、10 mmol/L EDTA和5 g/L PVPP)，冰浴上研磨勻漿，然后再低溫4℃ 12 000×g離心30 min，上清液即為粗酶提取液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。PG和Cx活性的測定用DNS比色法，PME活性測定采用NaOH滴定法［18］，β-Gal活性的測定使用 Na2CO3法。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗的平均值。采用SPSS軟件中的LSD法和Duncan法進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低強(qiáng)度微波處理后獼猴桃果實的溫度變化趨勢

低強(qiáng)度的微波也就是利用微波的非熱效應(yīng)，通過溫度和功率的強(qiáng)度變化來作用于物體，其果實溫度沒有明顯的變化，或者是溫度處于亞致死的情況下，溫度控制在20℃以下，這樣既可以產(chǎn)生很強(qiáng)的生物反應(yīng)，可以使果蔬的理化性質(zhì)，功能特性發(fā)生變化，也可以使其生理活性物質(zhì)發(fā)生變異而喪失活力或死亡。如圖1顯示的是經(jīng)過低強(qiáng)度的微波處理后獼猴桃果實的果實溫度變化趨勢，隨著功率和時間的增加溫度呈上升趨勢。

圖1 低強(qiáng)度微波處理皖翠獼猴桃的溫度變化趨勢Fig.1 Changing temperature trend of low intensity microwave treatments of“Wancui”kiwifruit

2.2 低功率微波處理對獼猴桃品質(zhì)的影響

2.2.1 對獼猴桃可溶性糖含量的影響

可溶性糖主要是指能溶于水的葡萄糖、果糖和蔗糖這3種糖，隨著果實的成熟，其含量在不斷地增加，在果實成熟過程中主要是通過果糖來表現(xiàn)，且果糖的甜度主要也是通過果糖來體現(xiàn)的。由表1可知，獼猴桃果實在貯藏過程中，可溶性糖呈上升趨勢，貯藏45 d時，每個處理組在不同的階段表現(xiàn)出了顯著差異(P＜0.05)，僅有少數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，例如65 W/3 min和32.5 W/7 min;32.5 W/3 min和32.5 W/11 min，且可以看出，適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚?，如?2.5 W/5 min和65 W/3 min可以抑制可溶性糖的上升，增加果實的品質(zhì)，提高的果實的實用價值和經(jīng)濟(jì)效益。

表1 低功率微波處理對獼猴桃可溶性糖含量的影響/%Table 1 Effect of low-power microwave treatment soluble sugar content of kiwifruit

2.2.2 對獼猴桃可滴定酸含量的影響

可滴定酸含量的多少對于獼猴桃的口感、風(fēng)味、pH值及貯藏性都有很大影響。如表2所示，獼猴桃的可滴定酸含量變化大體趨勢一致，都隨著貯藏時間的增加而不斷減少。從貯藏開始到最后，經(jīng)過不同的處理后果實的可滴定酸含量有著不同的變化，部分微波處理促進(jìn)了可滴定酸含量的下降，且處理間與對照差異不顯著(P＞0.05)例如，貯藏30 d時，對照組與32.5 W/3 min和32.5 W/11min差異不顯著，但是有些處理與對照存在明顯的差異(P＜0.05)，尤其是用32.5 W/5 min、65 W/3 min、32.5 W/7 min 和65 W/4 min處理的果實與對照組存在顯著差異。由此可見，適當(dāng)?shù)牡凸β饰⒉ㄌ幚慝J猴桃能夠抑制可滴定酸含量的下降，提高其果實的品質(zhì)下降。

表2 低功率微波處理對獼猴桃可滴定酸含量的影響/%Table 2 Effect of low-power microwave treatment titratable acid content of kiwifruit

2.2.3 對獼猴桃Vc含量的影響

獼猴桃果實具有較高的Vc，且果實本身在發(fā)育早期就含一定的Vc，在脫離母體后的綠熟期，Vc的合成仍會少量地進(jìn)行，但由于呼吸作用消耗使得有機(jī)物逐漸減少，合成Vc的底物不足，以及Vc的不穩(wěn)定性，容易分解，使果實的Vc含量在貯藏過程中逐漸減少。由表3可知，獼猴桃果實的Vc含量呈逐漸降低趨勢，但是15 d時，明顯呈上升趨勢。經(jīng)過不同的處理后，不同的處理在每個階段都有明顯的差異(P＜0.05)，32.5 W/5 min和65 W/3 min處理的果實與對照顯著差異(P＜0.05)，因此恰當(dāng)?shù)牡凸β饰⒉梢砸种芕c含量的降解，控制水果的營養(yǎng)價值不被損失，延長了其水果品質(zhì)。

表3 低功率微波處理對獼猴桃Vc含量的影響 單位:mg/100gTable 3 Effect of low-power microwave treatment Vc content of kiwifruit

2.2.4 對獼猴桃硬度的影響

硬度是指果實抗壓力的強(qiáng)弱，也是衡量果實品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是果實軟化的直觀表現(xiàn)。從表4可知，獼猴桃果實的硬度隨貯藏時間的延長呈下降趨勢，貯藏前60 d果實下降速度緩慢，下降范圍為2～3.5 N，其每個階段差異顯著(P＜0.05)，但有些處理差異不顯著(P＞0.05)，例如15d時32.5 W/3 min和32.5 W/9 min;65 W/3 min和65 W/4 min等，但在貯藏后期，獼猴桃果實的硬度急速下降，尤其在75 d時，每個處理組差異極顯著(P＜0.05)，其硬度下降速度由慢到快的順序依次為32.5 W/5 min＜65 W/3 min＜32.5 W/7 min＜65 W/2 min＜65 W/4 min＜65 W/5 min＜32.5 W/9 min＜32.5 W/11 min＜32.5 W/3 min＜對照組＜65 W/6 min，說明在皖翠獼猴桃在貯藏過程中，適當(dāng)?shù)臏囟群蜁r間組合的微波的非熱效應(yīng)可以減緩果實硬度下降的速度，尤其是用32.5 W/5 min和65 W/3 min處理的果實與對照顯著差異(P＜0.05)，對其硬度的保護(hù)作用更加明顯，明顯可以抑制果實的軟化。

表4 低功率微波處理對獼猴桃硬度的影響 單位:kg/cm2Table 4 Effect of low-power microwave treatment firmness of kiwifruit

2.3 低功率微波處理對獼猴桃多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的影響

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG，EC，3.1.1.15)是一類重要的水解酶，一度被認(rèn)為是控制果實軟化的關(guān)鍵酶，其主要功能是水解果實細(xì)胞壁中果膠酸的α-(1→4)-D-半乳糖苷酶，生成一些低聚的半乳糖醛酸或半乳糖醛酸，導(dǎo)致細(xì)胞壁解體，最終果實軟化［19-20］。由表5可知，獼猴桃果實在貯藏過程中呈先下降后上升的趨勢，貯藏0～15 d時，果實的PG酶活性下降，15 d以后，獼猴桃果實隨著果實的硬度逐漸下降，其PG的活性呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，直到貯藏值第75天時，PG活性上升的范圍為425.35～767.23 μg/(g·min)，且在這個貯藏時間，各處理間的差異性相當(dāng)顯著(P＜0.05)，且PG活性上升速度由慢到快為32.5 W/5 min＜65 W/3 min＜65 W/2 min＜32.5W/7 min＜32.5W/11 min＜65 W/5 min＜65 W/4 min＜32.5 W/9 min＜65W/6 min＜對照組＜32.5 W/3 min，說明在皖翠獼猴桃貯藏過程中，適當(dāng)?shù)蛷?qiáng)度的微波可以抑制PG酶活性的上升，根據(jù)分析，尤其是32.5 W/5 min和65 W/3 min處理的獼猴桃果實，可以維持獼猴桃果實的PG活性相對于對照低，降低細(xì)胞壁的破損，從而抑制了果實軟化的速度。

表5 低功率微波處理對獼猴桃多聚半乳糖醛酸酶活性的影響 單位:μg/(g·min)Table 5 Effect of low-power microwave treatment polygalacturonase activity of kiwifruit

2.4 低功率微波處理對獼猴桃果膠甲酯酶(PME)活性的影響

果膠甲酯酶(Pectinmethylesterase，PME，EC.3.1.1.11)廣泛存在于許多高等植物組織中，參與細(xì)胞壁果膠物質(zhì)的脫甲基化，在果膠甲酯酶的作用下，高分子質(zhì)量果膠中的半乳糖醛酸殘基的C6移除，留下了大量的自由的羧基群，細(xì)胞壁的pH值改變，通過鈣離子連接成凝膠結(jié)構(gòu)，使多聚糖更容易被PG降解。此外，PME能從細(xì)胞壁的果膠中去除甲基基團(tuán)，從而加速了細(xì)胞壁的降解，而PME的脫甲基產(chǎn)物又是PG作用的基質(zhì)，因此，PME的作用可能是加速果實的成熟軟化。從表6可以看出，果膠甲酯酶的活性為先下降后上升的趨勢，其中部分微波處理的果實的果膠甲酯酶活性明顯上升速度緩慢，貯藏15 d之前，酶活性緩慢下降，15 d～75 d時呈緩慢上升，75 d后酶活性急劇上升，加快了果實軟化的速度，但是在75 d時，每組處理間差異性相當(dāng)顯著(P＜0.05)，且各處理間酶活性上升的速度由慢到快依次為65 W/3 min＜32.5 W/5 min＜65 W/4 min＜32.5 W/7 min＜32.5 W/3 min＜65 W/2 min＜32.5 W/9 min＜對照組＜65 W/6 min＜32.5 W/11 min＜65 W/5 min，說明微波的非熱效應(yīng)對獼猴桃果實貯藏有一定的抑制作用，可以抑制PME活性的上升，延緩果實的軟化，提高了果實的貨架期。

表6 低功率微波處理對獼猴桃果膠甲酯酶活性的影響Table 6 Effect of low-power microwave treatment pectinmethylesterase activity of kiwifruit

2.5 低功率微波處理對獼猴桃纖維素酶(Cx)活性的影響

纖維素酶(Cellulase，Cx，EC3.2.1.4)作為細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)，在細(xì)胞壁降解過程中起了非常重要作用的一種細(xì)胞壁酶。它的主要功能是分解含1，4-β-葡萄糖基鏈的半纖維素的多糖，在不同的組織中，它們針對不同的多糖底物起作用。從表7可以看出，0～15 d果實的纖維素酶急劇下降，抑制了果實細(xì)胞壁的降解，15 d后，酶活性呈現(xiàn)上升趨勢，但在75 d時每組處理果實的酶活性之間存在著明顯的差異(P＜0.05)，其酶活性由慢到快的變?yōu)?2.5 W/5 min＜32.5 W/7 min＜65 W/3 min＜65 W/2 min＜32.5 W/3 min＜32.5 W/9 min＜對照組＜65 W/4 min＜32.5 W/11 min＜65 W/5 min＜65 W/6 min，根據(jù)其酶活性變化程度可知，適當(dāng)?shù)奈⒉〞r間和功率的組合，在一定程度上抑制了細(xì)胞壁的降解，降低了果實軟化的速度。

表7 低功率微波處理對獼猴桃纖維素酶活性的影響 單位:μg/(g·min)Table 7 Effect of low-power microwave treatment cellulase activity of kiwifruit

2.6 低功率微波處理對獼猴桃 β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性的影響

β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，β-Gal，)也作為一種細(xì)胞壁降解相關(guān)的酶，它可以使細(xì)胞壁的一些組分變得不穩(wěn)定，主要作用于鼠李半乳聚糖骨架的支鏈殘基，降解果膠聚合體，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而使果實軟化［21］。從表8可知，β-Gal活性呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，0～15 d酶活性急劇下降，15～30 d時急劇上升，30 d之后，酶活性呈緩慢上升趨勢，在75 d時，32.5 W/5 min和32.5 W/7 min;65 W/2 min和65 W/6 min;32.5 W/3 min和65 W/5 min差異性不顯著(P＞0.05)，與其他處理組之間差異性顯著(P＜0.05)，其酶活性變化的程度由慢到快的趨勢為65 W/3 min＜(32.5 W/5 min和32.5 W/7 min)＜65 W/4 min＜(65 W/2 min和65 W/6 min)＜(32.5 W/3 min和32.5 W/5 min)＜32.5 W/11 min＜32.5 W/9 min＜對照組，因此適當(dāng)?shù)奈⒉ǖ姆菬嵝?yīng)對果實酶活性的上升有一定的抑制作用，防止了果實的軟化，從而延長其貨架期。

表8 低功率微波處理對獼猴桃β-半乳糖苷酶活性的影響 單位:μg/(g·min)Table 8 Effect of low-power microwave treatment β-Galactosidase activity of kiwifruit

3 討論與結(jié)論

果實軟化是果實成熟的重要特征之一，果肉的軟化與果實的硬度以及細(xì)胞壁降解的酶有密切的關(guān)系。因果實在貯藏過程中，隨果實的軟化，果實的硬度下降，Vc含量隨著果實的成熟降解，滴定酸含量下降，可溶性糖會上升，細(xì)胞壁降解酶活性發(fā)生變化與硬度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果表明，32.5 W/5 min和65 W/3 min的低強(qiáng)度微波功率和時間選擇，對果實的軟化有很好的保護(hù)作用，由此說明，只有恰當(dāng)?shù)墓β屎蜁r間的變化才會很好地抑制細(xì)胞壁的降解，保證果實的品質(zhì)不會下降，延長其果實的貨架期，提高了果實的營養(yǎng)價值。果實貯存75 d之前，果實的硬度緩慢下降，變化幅度比較小，PG和PME活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，且PG和PME活性上升的速度是果實的硬度下降的區(qū)域，表現(xiàn)出PG活性和PME與果實硬度呈明顯的負(fù)相關(guān)。周培根等［22］的研究結(jié)果也表明，隨著桃果實的成熟，PG活性呈上升趨勢，果實的硬度下降;陸勝明等［23］的研究結(jié)果證明，PME在青梅果實的軟化中發(fā)揮著重大的作用。Cx和β-Gal活性呈現(xiàn)出先急劇下降后上升的趨勢，其變化程度也和果實硬度的下降呈負(fù)相關(guān)。前人已經(jīng)在蘋果、番木瓜、青梅等果實方面進(jìn)行了研究，結(jié)果表明果實的硬度下降與 Cx和 β-Gal活性有密切的關(guān)系。因此，32.5 W/5 min和65 W/3 min微波功率與時間的組合可以對皖翠獼猴桃果實軟化有抑制作用，延緩了果實的可溶性糖含量的上升和果實硬度、可滴定酸含量和Vc含量的下降，抑制了細(xì)胞壁酶降解的速度，保持了果實的商品價值。有關(guān)微波處理對果實細(xì)胞壁降解酶的機(jī)理已從分子方面進(jìn)行深入研究。

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