依達(dá)拉奉和遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌再灌注損傷的保護(hù)

李知平，張 曙，李恒昌，林永鋒，謝海輝(廣東省東莞市人民醫(yī)院麻醉科，東莞 5308;廣州市第一人民醫(yī)院麻醉科;通訊作者，E-mail:lzp3338@63.com)

藥物后處理和遠(yuǎn)隔缺血后處理是近年對(duì)抗心肌缺血-再灌注損傷的重大發(fā)現(xiàn)，其均是在心肌缺血發(fā)生后實(shí)施，具有補(bǔ)救作用、操作簡(jiǎn)單及廉價(jià)(遠(yuǎn)隔缺血后處理)等優(yōu)點(diǎn)［1，2］。心肌缺血 -再灌注損傷的機(jī)制復(fù)雜且尚未完全闡明，現(xiàn)有治療藥物或治療方法比較單一。依達(dá)拉奉是一種新型自由基清除劑，以往的動(dòng)物腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)證明可以減輕腦缺血再灌注損傷，理論上講依達(dá)拉奉用于心肌缺血再灌注保護(hù)具有很大潛力［3］，所以我們引入依達(dá)拉奉后處理和遠(yuǎn)隔缺血后處理聯(lián)合應(yīng)用，以探討其機(jī)制及是否具有協(xié)同作用，為心肌缺血-再灌注損傷尋求更加有效的治療藥物和新的治療途徑。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物選擇

健康雄性SD大鼠40只，8周齡，體重250-300 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為5組(n=8):假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、依達(dá)拉奉后處理組(E組)、遠(yuǎn)隔缺血后處理組(P組)、依達(dá)拉奉聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血后處理組(EP組)。

假手術(shù)組(S組)開(kāi)胸，冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)穿線但不結(jié)扎，觀察210 min;缺血再灌注組(I/R組)開(kāi)胸，結(jié)扎LAD 30 min，再灌注180 min;依達(dá)拉奉后處理組(E組)開(kāi)胸，結(jié)扎LAD 30 min，在再灌注前1 min經(jīng)主動(dòng)脈根部給予依達(dá)拉奉3 mg/kg，然后再灌注180 min;遠(yuǎn)隔缺血后處理組(P組)開(kāi)胸，結(jié)扎LAD至20 min時(shí)，同時(shí)用止血帶結(jié)扎大鼠雙下肢，LAD結(jié)扎至30 min時(shí)，同時(shí)開(kāi)放LAD及雙下肢，實(shí)施心臟再灌注180 min;依達(dá)拉奉聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血后處理組(EP組)方法同P組，不同的是在同時(shí)開(kāi)放LAD及雙下肢前1 min，經(jīng)主動(dòng)脈根部給予依達(dá)拉奉3 mg/kg，然后再實(shí)施心臟灌注180 min。

1.3 遠(yuǎn)隔缺血后處理方法

在大鼠雙后肢中、上1/3部位止血帶結(jié)扎，顏色呈絳紫色，多普勒超聲檢查驗(yàn)證股動(dòng)脈血流完全停止示肢體缺血成功，10 min后恢復(fù)再灌注。

1.4 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立

腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg，麻醉后仰臥位固定。采用ECGⅡ?qū)?lián)監(jiān)測(cè)心電圖。氣管切開(kāi)插管，連接DH.150小型動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠)。經(jīng)右頸總動(dòng)脈插導(dǎo)管至左心室，連接BL.420E+生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)(四川泰盟科技有限公司)，以監(jiān)測(cè)心臟功能指標(biāo)。沿鎖骨中線縱行切開(kāi)皮膚約2 cm，在第3或第4肋間鈍性分離肌層，打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間平左心耳下緣5 mm處行左冠狀動(dòng)脈前降支穿線，并用硅膠管套線，阻斷時(shí)在貼緊硅膠管的上端用止血鉗夾緊線，缺血30 min，ECGⅡ?qū)?lián)ST段明顯抬高0.1 mV或T波高聳，心肌顏色變暗紅示心肌缺血成功。松開(kāi)止血鉗，抬高的ST段或高聳的T波快速回落示再灌注成功。S組左冠狀動(dòng)脈前降支穿線但不結(jié)扎。E組再灌注前1 min靜脈注射依達(dá)拉奉(批號(hào):86.100205，江蘇先聲藥業(yè)有限公司)3 mg/kg;P組心肌缺血20 min時(shí)行遠(yuǎn)隔缺血后處理，持續(xù)10 min;EP組遠(yuǎn)隔缺血后處理方法同P組，依達(dá)拉奉給藥方法同E組。

1.5 CK-MB、SOD、MDA 測(cè)定

CK-MB、SOD、MDA試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。CK-MB測(cè)定:再灌注180 min末，各組分別從右心耳取血1 ml，在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定CK-MB;SOD、MDA測(cè)定:再灌注180 min末打開(kāi)腹腔，從下腔靜脈取血，分離血清，-20℃保存待測(cè)，分別采用硫代巴比妥酸法和分光光度計(jì)法測(cè)定心肌組織MDA含量和SOD活性，具體操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 心肌梗死面積測(cè)定(infarct size，IS%)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束并抽取動(dòng)脈血樣后，再次結(jié)扎LAD，經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射1%伊文氏藍(lán)溶液2-3 ml。待大鼠口唇和遠(yuǎn)端肢體皮膚藍(lán)染后，經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射10%KCl溶液1-2 ml處死大鼠，迅速摘取心臟并在冰鹽水內(nèi)洗去表面和心室內(nèi)殘血，沿冠狀溝切除左、右心房，并將右心室剪去。將留存的左心室用食品保鮮膜包裹后放入-20℃冰箱內(nèi)保存60 min以上。在分析時(shí)將留存的大鼠左心室取出，自LAD結(jié)扎處水平向心尖方向垂直于左心室縱軸將凍硬的左心室均勻切成4-5片(厚度為1 mm)。采用數(shù)碼相機(jī)對(duì)切片橫截面拍照保存后，置入1%氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，37℃避光水浴10-15 min。然后將心肌切片放置在10%中性甲醛中固定過(guò)夜后，再次對(duì)切片橫截面利用數(shù)碼相機(jī)拍照。對(duì)獲得的數(shù)碼相片，采用Photoshop CS3 Extended軟件進(jìn)行測(cè)量處理，以計(jì)算心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)和梗死區(qū)占總橫截面的百分比。將心肌梗死區(qū)的百分比數(shù)值除以心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)的百分比數(shù)值即為IS%值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

與S組相比，其他各組灌注后CK-MB，IS%顯著增加(P＜0.01)，I/R組灌注后SOD活力降低，MDA的水平增高，EP組灌注后SOD活力增加(P＜0.05);與 I/R組相比，E組、P組和 EP組灌注后IS%減小，CK-MB、MDA的水平明顯降低(P＜0.01)，SOD 活力增加(P ＜0.05);EP組與 E 組、P組比較，CK-MB，MDA水平降低，SOD活力增加(P＜0.05)，IS%明顯減小(P ＜0.01，見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較(n=8，±s)Table 1 Com parison of serum biomarkers among five groups(n=8，±s)

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較(n=8，±s)Table 1 Com parison of serum biomarkers among five groups(n=8，±s)

與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 I/R 組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與聯(lián)合處理組比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01

指標(biāo) 時(shí)間 假手術(shù)組 缺血再灌注組 依達(dá)拉奉后處理組 遠(yuǎn)隔缺血后處理組 聯(lián)合處理組CK-MB(IU/L) 灌注前 13.5 ±9.6 13.7 ±8.5 13.9 ±6.8 13.8 ±7.4 13.6 ±8.5灌注后 14.5±10.3 2 659±1 358＊＊ 1 138±612##＊＊☆ 1 215±1 018##＊＊☆ 860±136##＊＊SOD(U/ml) 灌注前 98.6 ±7.5 99.2 ±6.9 98.4 ±7.2 99.8 ±8.3 97.9 ±5.6灌注后 100.1 ±6.8 90.3 ±4.9* 101.2 ±5.3#☆ 103.4 ±6.3#☆ 120.8 ±9.4*##MDA(nmol/ml) 灌注前 1.8 ±0.8 1.7 ±0.9 1.8 ±0.6 1.8 ±0.5 1.7 ±1.1灌注后 1.9 ±0.7 4.5 ±2.1* 2.5 ±0.8##☆ 2.6 ±0.5##☆ 1.7 ±0.6##IS(%) 灌注前 0 0 0 0 0灌注后 0 16.3±0.8＊＊ 8.2 ±0.3＊＊☆☆ 8.8 ±1.2＊＊☆☆ 4.2±1.0＊＊

3 討論

Wang等［4］在大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，激活 k受體對(duì)缺血預(yù)處理減少心肌梗死面積和抗心律失常作用均非常重要。Zhang等［5］證實(shí)，通過(guò)阻斷股動(dòng)脈造成大鼠下肢短暫缺血實(shí)施RIP(遠(yuǎn)隔缺血后處理)的心肌保護(hù)作用是由k受體介導(dǎo)的。本研究采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，該方法是經(jīng)典的制備心肌缺血再灌注損傷模型的實(shí)驗(yàn)方法［6］。藥物后處理是指在再灌注時(shí)通過(guò)藥物治療而獲得的保護(hù)效應(yīng)，簡(jiǎn)便易行，且同樣具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值。

藥物后處理的保護(hù)效應(yīng)已被既往研究所證史［7］，早在 2005 年 Kerendi等［8］即發(fā)現(xiàn)了遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌I/RI的保護(hù)作用，但是關(guān)于遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)作用的機(jī)制目前尚未被完全揭示［9］。而且，各研究所采用的遠(yuǎn)隔缺血后處理方式也不盡相同［9］。Tamareille 等［10］在心肌 I/RI大鼠證實(shí)，于心肌缺血20 min時(shí)對(duì)大鼠后肢實(shí)施10 min的缺血和隨后再灌注能夠顯著降低心肌梗死體積。許亞超等［11］在心肌I/RI大鼠證明，于心肌缺血期對(duì)大鼠雙后肢實(shí)施10 min的缺血和隨后再灌注亦能產(chǎn)生明顯的心肌保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)參照既往研究［10，11］采用對(duì)心肌I/RI具有確切保護(hù)作用的后肢缺血10 min和隨后再灌注這一干預(yù)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。而且，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌I/RI具有明確的保護(hù)作用，此與既往研究結(jié)果相一致［11］。

依達(dá)拉奉的保護(hù)作用除傳統(tǒng)的抑制花生四烯酸脂氧合酶途徑外［12］，對(duì)羥自由基的有效清除可能是其產(chǎn)生強(qiáng)效心肌保護(hù)作用并區(qū)別于其他自由基清除劑的優(yōu)勢(shì)所在［13］。如果選擇合理的給藥劑量和途徑，依達(dá)拉奉藥物后處理可起到接近于缺血后處理組的心肌保護(hù)作用，二者過(guò)氧化產(chǎn)物的減少近似，本實(shí)驗(yàn)亦得到印證;更從另一方面證明了抑制自由基氧化應(yīng)激損傷是缺血后處理保護(hù)的重要機(jī)制，也是缺血后處理與依達(dá)拉奉藥物后處理二者保護(hù)作用的共同機(jī)制。國(guó)外也有對(duì)急性心肌梗死患者行直接PCI時(shí)采用依達(dá)拉奉藥物后處理減輕再灌注損傷的隨機(jī)、安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)，顯示依達(dá)拉奉是一種有效的再灌注器官保護(hù)藥物［14］。MDA是氧自由基攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的標(biāo)志產(chǎn)物［15］，而SOD的活力反應(yīng)了機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予缺血后處理與依達(dá)拉奉藥物后處理均能明顯降低血清MDA水平并提高SOD的活力，說(shuō)明機(jī)械性后處理與外源性給予依達(dá)拉奉藥物后處理均可大大提高機(jī)體的抗氧化能力。因而抑制再灌注早期的自由基氧化應(yīng)激損傷可能是機(jī)械性缺血后處理與依達(dá)拉奉藥物后處理保護(hù)作用的共同機(jī)制。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，依達(dá)拉奉后處理組和遠(yuǎn)隔缺血后處理都可減輕心肌缺血再灌注損傷，依達(dá)拉奉后處理聯(lián)合遠(yuǎn)隔缺血后處理明顯效果強(qiáng)于兩者單獨(dú)應(yīng)用。

［1］張永明，王禹.缺血后適應(yīng)-缺血再灌注心肌保護(hù)的新策略［J］.中國(guó)循環(huán)雜志，2007，22(4):319-320.

［2］Khner BA，Rezkalh SH.Preconditioning，postconditioning and their application to clinical cardiology［J］.Cardiovasc Res，2006，70:297-307.

［3］Higashi Y，Jitsuiki D，Chayama K，et al.Edarvone(3-methyl-lphenyl-2-pyrazolin-one)，a novel free radical scavenger，for treatment of cardiovascular diseases［J］.Recent Patents Cardiovasc Drug Discov，2006，l:85-93.

［4］Wang GY，Wu S，Pei JM，et al.Kappa-but not delta-opioid receptors mediate effects of ischemic preconditioning on both infarct and arrhythmia in rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280(1):384-391.

［5］Zhang SZ，Wang NF，Xu J，et al.Kappa-opioid receptors mediate cardioprotection by remote preconditioning［J］.Anesthesiology，2006，105(3):550-556.

［6］Chimenti S，Carlo E，Massort S，et al.Myocardial infarction:animal models［J］.Method Mol Med，2004，98:217-226.

［7］O’Sullivan JC，Yao XL Alam H，et al.Diazoxide，as a postconditioning and delayed preconditioning trigger，increases HSP25 and HSP70 in the central nervous system following combined cerebral stroke and hemorrhagic shock［J］.J Neaurotrauma，2007，24:523-546.

［8］Kerendi F，Kin H，Halkos ME，et al.Remote postconditioning.Brief renal ischemia and reperfusion applied before coronary artery reperfusion reduces myocardial infarct size via endogenous activation of adenosine receptors［J］.Basic Res Cardiol，2005，100(5):404-412.

［9］Zhao ZQ.Postconditioning in reperfusion injury:a status report［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24(3):265-279.

［10］Tamareille S，Mateus V，Ghaboura N，et al.RISK and SAFE signaling pathway interactions in remote limb ischemic preconditioning in combination with local ischemic postconditioning［J］.Basic Res Cardiol，2011，106(6):1329-1339.

［11］許亞超，薛富善，熊軍，等.芬太尼后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2010，30(8):946-949.

［12］Atsuo Y，Masahito M，Kyozo I，et al.Cardioprotective effect of MCI-186(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)during acute ischemia-reperfusion injury in tats［J］.Int J Angiol，1994，3:12-15.

［13］Onogi H，Minatoguchi S，Chen XH，et al.Edaravone reduces myocardial infarct size and improves cardiac function and remodeling in rabbits［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33:1035-1041.

［14］Tsujita K，Shimomura H，Kawano H，et al.Effects of Edaravone on reperfusion injury in patients with acute myocardial infarction［J］.Am J Cardiol，2004，94:481-484.

［15］王禹，張永明，劉秀華，等.依達(dá)拉奉藥物后處理與缺血后處理對(duì)急性缺血再灌注心肌保護(hù)作用的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)循環(huán)雜志，2008，23(5):388-391.