FISH檢測痰脫落細胞3、8、9、17染色體異常情況，研究肺癌診斷新手段*

李林

FISH檢測痰脫落細胞3、8、9、17染色體異常情況，研究肺癌診斷新手段*

李林①

目的：應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)對痰脫落細胞染色體異常情況進行分析，探討FISH輔助診斷肺癌的可行性和有效性。方法：選擇2014年6月-2015年6月本院收治的疑似肺癌患者30例作為研究對象，采用3、8、9、17號染色體著絲粒探針對其痰脫落細胞進行FISH檢測并進行痰脫落細胞學(xué)檢查。結(jié)果：肺癌確診患者痰脫落細胞中3、8、9、17號染色體畸變陽性率分別為41.67%、45.83%、58.33%、41.67%；FISH檢測和痰脫落細胞學(xué)檢查的敏感度分別為83.33%和20.83%，特異性分別為66.67%和100%，診斷符合率分別為80.00%和36.67%，F(xiàn)ISH檢測敏感度和診斷符合率均高于痰脫落細胞學(xué)檢查，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：肺癌的發(fā)生發(fā)展與染色體畸變有關(guān)，F(xiàn)ISH檢查可明顯提高肺癌診斷準(zhǔn)確率，可作為肺癌診斷新手段。

肺癌； 熒光原位雜交； 痰脫落細胞

肺癌是當(dāng)今世界上最常見的威脅人類生命健康的惡性腫瘤[1]。近年來由于女性吸煙人群數(shù)量的逐漸增加，肺癌總發(fā)病率也隨之顯著增加[2]。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明，肺癌的發(fā)病率和死亡率均占我國大多數(shù)城市惡性腫瘤的首位。影像學(xué)檢查如胸部X射線、CT檢查、肺穿刺活檢，支氣管鏡檢查和痰脫落細胞學(xué)檢查均是臨床診斷肺癌的有效手段，MiRNA作為血清標(biāo)志物也為肺癌早期診斷提供了新的研究途徑[3-4]。與其他方法相比，痰脫落細胞學(xué)檢查具有取材簡單、安全、患者無創(chuàng)傷等優(yōu)點，且可以判斷腫瘤的組織學(xué)類型，對肺癌的治療有重要意義。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)是一門新興的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，可用于檢測染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常變化，為惡性腫瘤的研究提供了新的技術(shù)支持，目前被廣泛用于診斷尿路上皮癌、血液系統(tǒng)腫瘤以及宮頸癌等惡性腫瘤[5]。本研究利用FISH技術(shù)檢測30例疑似肺癌患者痰脫落細胞3、8、9、17號染色體異常情

況，探討FISH作為肺癌診斷新手段的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年6月-2015年6月本院收治的疑似肺癌患者30例作為研究對象，其中女10例，男20例，年齡45～78歲，中位年齡65歲。經(jīng)病理學(xué)診斷證實為肺癌24例，其中鱗癌14例，小細胞肺癌3例，腺癌7例；TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期9例，Ⅲ～Ⅳ期15例。良性病變6例，其中肺炎3例，肺結(jié)核3例。

1.2 方法 收集新鮮痰液，囑患者晨起后去除口腔唾液，陳腐痰及鼻腔分泌物，并咯出喉部痰液，取漱口后深呼吸用力咯出的肺部痰液2～3口，連續(xù)3 d，留置于無菌盛痰瓶中，每例收集約20mL，分為2等份各為10mL，送檢處理，分別用于FISH檢測和常規(guī)痰細胞檢測，具體方法如下。

1.2.1 FISH檢測

1.2.1.1 痰標(biāo)本的制備 將收集到的10mL新鮮痰液放入置有Sacco manno固定液的試管固定[6]。用攪拌棒攪勻后，1500 r/min，離心10min棄去上清，0.25%膠蛋白酶室溫消化10min后，加入血清終止消化，1500 r/min，離心10min棄去上清。PBS洗滌后，1500 r/min，離心10min棄去上清，用Sacco manno固定液重懸細胞，滴在載玻片上。

1.2.1.2 探針選擇 選擇3、8、9和17號染色體為研究對象進行標(biāo)記和檢測。雜交時3號和17號為一組，8號和9號為一組做雙色熒光原位雜交，3、8號標(biāo)記為紅色，9、17號標(biāo)記為綠色。

1.2.1.3 FISH實驗 （1）探針雜交混合物配制：將1×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液（SSC）、55%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、1 mg/mL鮭魚精DNA配成20 ng/mL探針雜交混合物。（2）探針變性：將配好的探針雜交混合物于75 ℃水溶變性10min，變性后立即入冰，加到染色體載玻片上染色。（3）載玻片的雜交前處理：70%乙酸處理10min；PBS洗3次，5min/次；100 mg/L核糖核酸酶A，2×SSC 37 ℃消化60min，2×SSC洗3次，5min/次；70%、90%、100%乙醇梯度脫水處理各3min，風(fēng)干；70%甲酰胺、2×SSC 75 ℃變性各3min；立即入冷70%、90%、100%乙醇脫水各處理3min，風(fēng)干。（4）雜交：將變性過的探針加到上述變性的載玻片上，rubber solution封片，放置在濕盒中37 ℃雜交過夜。（5）雜交后洗滌：雜交結(jié)束后，載玻片在42 ℃的50%甲酰胺，2×SSC中洗3次，5min/次，2×SSC中洗3次，5min/次。（6）檢測：將玻片置于室溫70%乙醇中洗滌3min，取出后在暗處風(fēng)干，在樣本區(qū)域滴加15μL DAPI，蓋上蓋玻片，避光保存15～20min。（7）結(jié)果觀察：用NIKON熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.1.4 對照研究 上述4個染色體特異探針和8例健康人（其中男5例，女3例）的外周血細胞中期分裂染色體雜交，以確證各探針雜交的特異性并計數(shù)400個細胞中具有≤1個雜交信號和≥3個雜交信號的細胞比例，用于計算每個探針具有≤1個雜交信號和≥3的雜交信號的細胞的99%可信限（上限），作為判定標(biāo)本中異倍體的標(biāo)準(zhǔn)，選擇具有某一雜交信號異常數(shù)目的細胞所占的比例≥10%作為制定異常信號的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.1.5 質(zhì)量控制 每一批雜交試驗都帶一張正常血細胞的染色體片，若雜交后，正常染色體片中各探針具有2個雜交信號的比例明顯低于對照研究中的平均比例，或雜交信號很多，難以分辨，則視為該次雜交失敗，棄之重新雜交。

1.2.2 痰脫落細胞學(xué)檢測 將收集好的患者新鮮痰液10mL標(biāo)本送常規(guī)細胞病理學(xué)檢查，連送3d。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照研究 計算出的99%可信限（上限）作為結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)：即患者標(biāo)本中具有1個3、8、9、17號染色體雜交信號的細胞所占的百分比分別為≥3.83%、≥3.61%、≥4.73%、≥3.77%時視為丟失；有≥3個3、8、9、17號染色體雜交信號的細胞所占的百分比分別為≥4.72%、≥4.84%、≥2.75%、≥4.91%時視為染色體拷貝數(shù)增多，見表1。

表1 正常細胞中染色體數(shù)目畸變率 %

2.2 肺癌患者染色體畸變分析及探針診斷肺癌 肺癌患者新鮮痰液中染色體均存在不同程度的畸變：3號染色體表現(xiàn)為單體、三體、四體或者多體或3p缺失；8號染色體表現(xiàn)為單體，三體，四體或多體，也可表現(xiàn)為8p；9號染色體多表現(xiàn)為9p缺失，也可表現(xiàn)為完全缺失；17號染色體表現(xiàn)為三體、四體或多體。3、8、9、17號染色體探針單獨使用敏感度均低于4種染色體探針聯(lián)合使用，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 4種染色體探針及其組合診斷肺癌結(jié)果比較

2.3 FISH與痰脫落細胞學(xué)檢測肺癌的敏感度和特異性比較 FISH檢測的敏感度、診斷符合率均高于痰脫落細胞學(xué)檢測，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 FISH與痰脫落細胞學(xué)檢測肺癌的敏感度、特異性及診斷符合率比較 %

續(xù)表3

3 討論

肺癌死亡率居高不下的主要原因在于多數(shù)肺癌患者確診時已是晚期，即使采用綜合治療方法，患者治愈率仍不盡如人意[7]。如何提高肺癌早期診斷率成為降低肺癌高死亡率的重要課題。痰是氣管或支氣管的分泌物和肺泡的滲出物借助于支氣管黏膜上皮纖毛運動，管壁平滑肌的收縮和咳嗽的氣流的口腔排出物。利用痰細胞學(xué)檢查診斷技術(shù)是肺癌高發(fā)人群進行防癌篩查的一種常規(guī)檢測手段，但痰脫落細胞學(xué)檢查肺癌檢出率較低，特異性較差[8]。因此尋找一種特異性和敏感性較高，可輔助痰脫落細胞學(xué)檢查診斷肺癌的方法，成為肺癌早期診斷研究的新方向。

相關(guān)研究結(jié)果表明，肺癌的發(fā)展與染色體不穩(wěn)定性密切相關(guān)，特別是與3、8、9、17號染色體的非整倍體有關(guān)。3號染色體短臂（3p）和9號染色體短臂（9p）上遺傳物質(zhì)丟失是早期肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的頻發(fā)事件[9]。高樹庚等[10]用FISH對21例非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）短期培養(yǎng)的肺癌組織和癌旁支氣管上皮細胞中3p和9p丟失進行分析，21例中均檢測到3p或9p丟失，3p和9p共同丟失率為57.14%（12/21），3p或9p單獨丟失率為42.86%（9/21），9p丟失率在肺癌組織和癌旁支氣管上皮細胞中均比3p高，提示肺癌發(fā)生發(fā)展過程中9p丟失發(fā)生可能性更大。

8號染色體拷貝數(shù)增多與肺癌晚期、高分級有一定關(guān)系。8q22～q24是c-myc基因染色體定位區(qū)域，c-myc基因激活后，與細胞增殖相關(guān)的核蛋白p62作為其產(chǎn)物過度表達，從而使細胞快速增殖[11]。謝菁等[12]利用FISH檢測肺癌間期細胞部分染色體數(shù)目改變，結(jié)果表明8號染色體在NSCLC和SCLC中擴增率分別是46.2%和43.75%，且8號染色體擴增現(xiàn)象隨著臨床病理分期的進展更加明顯，但二者間無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。因此，8號染色體拷貝數(shù)增多可能會引起c-myc基因擴增，參與了肺癌形成的進展階段。

多個與腫瘤相關(guān)的基因如抑癌基因p53，腫瘤分化與轉(zhuǎn)移相關(guān)HER2/neu基因等均定位于17號染色體上，17號染色體異常的意義更為重要。p53是研究較早較為深入的一種抑癌基因，60%～70%的惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)p53的2個等位位點有突變或缺失存在，p53基因突變的腫瘤惡性程度相對較高，易侵襲周圍組織或者向遠處轉(zhuǎn)移。Brabender等[13]發(fā)現(xiàn)，HER2/neu基因表達過度，EGFR和HER2/neu高水平共表達均作為影響NSCLC預(yù)后不良的因素，EGFR和HER2/neu對NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)及選擇是否接受密集輔助治療有重要作用。Onn等[14]進一步研究發(fā)現(xiàn)，EGFR和HER2/neu在蛋白水平同步過表達可增加復(fù)發(fā)可能性，降低NSCLC1期患者存活率，這一研究結(jié)果為靶向治療提供了方向。

FISH技術(shù)以熒光標(biāo)記的單鏈核苷酸為探針，遵循堿基互補配對原則，與待測未知單鏈核苷酸雜交，通過熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞內(nèi)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變情況。FISH技術(shù)敏感性高，特異性好，操作簡單，空間定位精確，結(jié)果觀察直接清晰，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于一些實體瘤的診斷和先天性疾病的產(chǎn)前診斷[15]。利用FISH技術(shù)檢測痰脫落細胞染色體異常情況也被證實為可行，F(xiàn)ISH聯(lián)合常規(guī)痰脫落細胞學(xué)檢查可明顯提高肺癌診斷準(zhǔn)確率，可作為肺癌診斷新手段[16]。

本研究30例疑似肺癌患者，經(jīng)病理確診為肺癌24例，良性病變6例。統(tǒng)計結(jié)果分析，痰脫落細胞學(xué)特異性（100%）雖然高于FISH檢測結(jié)果（66.67%），但兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在24例肺癌確診患者中，F(xiàn)ISH檢測陽性20例（83.33%），而痰脫落細胞學(xué)檢測陽性5例（20.83%），陽性檢出率FISH檢測明顯高于痰脫落細胞學(xué)檢測，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。敏感度和診斷符合率結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH檢測明顯均優(yōu)于痰脫落細胞學(xué)檢測，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Voss等[17]在137例疑似肺癌患者支氣管鏡檢樣本中選取78例，F(xiàn)ISH檢測檢測出肺癌的敏感

度（71%）明顯高于傳統(tǒng)細胞學(xué)檢查（51%）（P=0.07），該結(jié)果與本文研究結(jié)果一致。楊曉東等[18]研究結(jié)果顯示，自發(fā)性熒光支氣管鏡組肺癌確診率明顯優(yōu)于白光電子支氣管鏡組，對肺癌早期診斷有重要價值。

本研究確診肺癌24例，早期（Ⅰ～Ⅱ期）9例，晚期（Ⅲ～Ⅳ期）15例。Rivera等[19]研究表明，取得脫落腫瘤細胞的容易程度與腫瘤的大小成正比關(guān)系，即腫瘤越大，越易取得脫落腫瘤細胞，晚期痰脫落腫瘤細胞相對于早期痰脫落腫瘤細胞敏感度更高。本研究中，早期肺癌痰脫落細胞學(xué)敏感度為11.11%（1/9），晚期的敏感度26.67%（4/15），與上述結(jié)果相一致。但也有部分學(xué)者持其他觀點，咳出的痰液細胞質(zhì)量高低直接影響痰脫落細胞診斷結(jié)果，Miller等[20]研究結(jié)果表明，至少有10%的痰液標(biāo)本不足以檢測痰脫落細胞形態(tài)。本研究結(jié)果中，F(xiàn)ISH檢測早期肺癌敏感度66.67%和晚期肺癌敏感度80.00%均高于痰脫落細胞學(xué)檢測，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

本組24例確診肺癌痰脫落細胞標(biāo)本中，4種染色體探針聯(lián)合使用相比于單獨使用1種染色體探針可提高FISH檢測的敏感性。肺癌發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因多步驟的過程，染色體非整倍體改變是痰脫落腫瘤細胞的重要特征，對于肺癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有重要意義。FISH技術(shù)可以明顯提高染色體異常的檢出率，一方面說明FISH技術(shù)提供了直接觀察大量肺癌細胞遺傳學(xué)改變的手段，能夠反映某一染色體數(shù)量改變的范圍和分布情況；另一方面也論證了FISH技術(shù)檢測肺癌中染色體異常的可行性，為臨床肺癌患者的診斷、病理分類、預(yù)后及治療方案的選擇提供新的依據(jù)。綜上所述，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測3、8、9、17號染色體異常情況，可明顯提高早期肺癌檢出率，對肺癌早期診斷、早期治療及肺癌治療效果的提高有重要價值，可作為肺癌診斷的輔助手段在臨床推廣應(yīng)用。

[1] Spiro S G，Porter J C.Lung cancer-where are we today?Current advances in staging and nonsurgical treatment[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2002，166（9）：1166-1196.

[2] Jemal A，Travis W D，Tarone R E，et al.Lung cancer rates convergence in young men and women in the United States：analysis by birth cohort and histologic type[J].International Journal of Cancer，2003，105（1）：101-107.

[3] Varella-Garcia M.Molecular cytogenetics in solid tumors：laboratorial tool for diagnosis， prognosis， and therapy[J].The Oncologist，2003，8（1）：45-58.

[4]曾鳳枝.MiRNA及其與肺癌早期診斷的新認識[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（30）：154-156.

[5]曹志星，呂威，趙曄，等.FISH檢測宮頸上皮內(nèi)瘤變及其旁組織中hTERC基因表達的變化及意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（23）：1-6.

[6] Saccomanno G，Saunders R P，Ellis H，et al.Concentration of carcinoma or atypical cells in sputum[J].Acta cytologica，1963，1（7）：305-310.

[7]蘇忠，陳宏.肺癌的綜合治療[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2009，6（31）：151-152.

[8]李劍穎.痰細胞學(xué)檢查在肺癌診斷中的臨床價值[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010，7（15）：137-138.

[9] Caballero O L，Cohen D，Liu Q，et al.Loss of chromosome arms 3p and 9p and inactivation of P16INK4a in normal epithelium of patients with primary lung cancer[J].Genes，Chromosomes and Cancer，2001，32（2）：119-125.

[10]高樹庚，董向陽.人肺癌組織3p和9p丟失的研究[J].腫瘤防治雜志，2002，9（4）：359-361.

[11] Kubokura H，Tenjin T，Akiyama H，et al.Relations of the c-myc gene and chromosome 8 in non-small cell lung cancer：analysis by fluorescence in situ hybridization[J].Annals of Thoracic and Cardiovascular Surgery，2001，7（4）：197-203.

[12]謝菁，薛永權(quán)，黃建安，等.應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測肺癌間期細胞部分染色體數(shù)目的改變[J].中國綜合臨床，2006，22（1）：30-33.

[13] Brabender J，Danenberg K D，Metzger R，et al.Epidermal growth factor receptor and HER2-neu mRNA expression in non-small cell lung cancer is correlated with survival[J].Clinical Cancer Research，2001，7（7）：1850-1855.

[14] Onn A，Correa A M，Gilcrease M，et al.Synchronous overexpression of epidermal growth factor receptor and HER2-neu protein is a predictor of poor outcome in patients with stage I non-small cell lung cancer[J].Clinical Cancer Research，2004，10（1）：136-143.

[15] Speicher M R，Carter N P.The new cytogenetics：blurring the boundaries with molecular biology[J].Nature Reviews Genetics，2005，6（10）：782-792.

[16] Varella-Garcia M Schulte A P，Wolf H J，et al.The detection of chromosomal aneusomy by fluorescence in situ hybridization in sputum predicts lung cancer incidence[J].Cancer Prevention Research，2010，3（4）：447-453.

[17] Voss J S，Kipp B R，Halling K C，et al.Fluorescence in situ hybridization testing algorithm improves lung cancer detection in bronchial brushing specimens[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2010，181（5）：478-485.

[18]楊曉東，鮑文華，張智勇，等.熒光支氣管鏡在肺癌早期診斷中的臨床分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（14）：74-76.

[19] Rivera M P，Mehta A C.Initial diagnosis of lung cancer：ACCP evidence-based clinical practice guidelines[J].CHEST Journal，2007，132（3 suppl）：131S-148S.

[20] Miller Y E，Vu K O，Kennedy T C，et al.Lack of association between sputum atypia and chronic obstructive pulmonary disease mortality[J].Journal of Thoracic Oncology，2006，1（4）：302-307.

Research on a New Mean for the Diagnosis of Lung Cancer：Fluorescence in Situ Hybridization in the Detection of Abnormalities of Chromosome 3，8，9，17 in Exfoliated Cells of Sputum Samples/

LI Lin.//Medical Innovation of China，2015，12（32）：001-004

Objective：To analyze the chromosome abnormalities of exfoliated cells in sputum samples by fluorescence in situ hybridization and to explore the possibility and validity of FISH examination for the diagnosis of lung cancer.Method：30 patients who were suspected with lung cancer in our hospital from June 2014 to June 2015 were selected as the research objects.They were given FISH examination by using centromeric probes of chromosome 3，8，9，17 to examine chromosome abnormalities of sputum exfoliated cells，sputum cytology detection was also given to them.Result：The aberration rate of chromosomes 3，8，9 and 17 in lung cancer patients’ sputum exfoliated cells were 41.67%，45.83%，58.33% and 41.67% respectively.The sensitivity of FISH and sputum cytology detection were 83.33% and 20.83% respectively，the specificity of them were 66.67% and 100% respectively and the diagnostic accordance rate of them were 80.00% and 36.67% respectively.The sensitivity and the diagnostic accordance rate of the FISH examination were higher than those of the sputum cytology detection，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Chromosome aberrations plays an important role in the development of lung cancer.FISH technique can significantly improve the accuracy rate of diagnosis for lung cancer.It can be used as a new mean for the diagnosis of lung cancer.

Lung cancer； Fluorescence in situ hybridization； Sputum exfoliated cell

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.32.001

2015-07-29） （本文編輯：王利）

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃（20155485）

①江西省腫瘤醫(yī)院 江西 南昌 330029

李林

First-author’s address：The Tumor Hospital of J iangxi Province，Nanchang 330029，China