生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶微生物法檢測(cè)

李欣南，韓鐫竹，蘇崴藝

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，沈陽(yáng)110016）

0 引言

生鮮乳是當(dāng)前百姓生活中不可缺少的食品之一，但是隨著飼料產(chǎn)品及投入成本的增加，造成許多不法商販向生乳中摻入糊精、三聚氰胺、植物末和β-內(nèi)酰胺酶等有毒有害物質(zhì)[1-3]，給消費(fèi)者的身體健康帶來(lái)潛在的危害。其中β-內(nèi)酰胺酶是微生物產(chǎn)生的，主要作用于β-內(nèi)酰胺類抗生素的一類酶。該酶的使用掩蓋了牛奶中實(shí)際含有的抗生素，使青霉素、頭孢菌素等抗生素藥物耐藥性增高，長(zhǎng)期使用的危害還沒有明確的報(bào)道，但是作為細(xì)菌耐藥性機(jī)制之一，其有可能誘導(dǎo)人體內(nèi)正常菌株的耐藥性的產(chǎn)生，從而降低人們抵抗傳染病的能力。

1 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法及原理

現(xiàn)階段，生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法采用的是衛(wèi)生部制定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)檢驗(yàn)方法杯碟法》[4-5]，該方法可以檢測(cè)出生鮮乳中未反應(yīng)完全的β-內(nèi)酰胺酶，可用于檢測(cè)未經(jīng)過任何加工的牛奶，并且檢出限較低，容易區(qū)分外源性和內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶。其檢測(cè)原理是以一種對(duì)青霉素高度敏感的細(xì)菌作為指示菌，實(shí)驗(yàn)時(shí)如果被測(cè)牛奶樣品含有青霉素酶，破壞了青霉素，指示菌株即可生長(zhǎng)，否則指示菌將被抑制。同時(shí)，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)抑菌圈的大小，可以定量地確定β-內(nèi)酰胺酶的含量[6-7]。崔生輝等[8]運(yùn)用β-內(nèi)酰胺酶特異性抑制劑舒巴坦建立了該酶的檢測(cè)方法，該方法在牛奶中的檢出限為4 U/mL。目前，微生物法仍然是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的主要方法。

2 方法

參照農(nóng)業(yè)部指定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)檢驗(yàn)方法杯碟法》[4]。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)控制[9]

（1）青霉素的工作液的制備。青霉素標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按百分含量折算后進(jìn)行稱量，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)當(dāng)現(xiàn)用現(xiàn)配，確保容量瓶無(wú)殘留，防止交叉污染。

（2）舒巴坦工作液的制備。舒巴坦的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制后可分裝冷凍保存一周，避免反復(fù)凍融，配制時(shí)應(yīng)確保容量瓶無(wú)殘留，防止交叉污染。

（3）β-內(nèi)酰胺酶工作液的制備。β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)進(jìn)行活力測(cè)定或購(gòu)買標(biāo)注活力單位的標(biāo)準(zhǔn)品。β-內(nèi)酰胺酶活力測(cè)定參見中國(guó)獸藥典一部附錄128—青霉素酶及活力測(cè)定法，配制及洗刷時(shí)應(yīng)單獨(dú)操作，避免污染容器和操作界面。一般工作液濃度應(yīng)控制在4000～6000 U/mL。

2.2 菌種控制

采用對(duì)青霉素類藥物絕對(duì)敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株藤黃微球菌（CMCC(B)28001），實(shí)驗(yàn)菌株應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生株。剛購(gòu)置的菌種凍干粉應(yīng)在-20℃冷凍保存，臨用前活化，標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按照供應(yīng)上提供的說(shuō)明或按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行?；罨蟮木N為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)制備培養(yǎng)液，分裝后于-20℃以下甘油冷凍保存。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制作每月或每次實(shí)驗(yàn)用的工作菌株，工作菌株應(yīng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面保存，一般可冷藏保存1個(gè)月。

菌種傳代使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)溫度為28℃培養(yǎng)48 h。傳代后菌株在斜面上應(yīng)為濕潤(rùn)密布生長(zhǎng)，無(wú)褶皺和裂紋，亮黃色菌苔。菌種傳代不宜超過14代。14代后菌種的活力下降會(huì)給檢驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)誤差。超過14代應(yīng)重新挑取液體保存菌種重新傳代。

2.3 器皿控制

檢測(cè)中所用器皿及耗材，如培養(yǎng)皿、試管、牛津杯等應(yīng)清洗干凈，不得有清潔劑等抑菌物質(zhì)殘留。

（1）實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿應(yīng)為內(nèi)徑為90 mm的玻璃平皿，高度應(yīng)大于20 mm，避免加入牛津杯后總高度高出平皿邊緣。

（2）實(shí)驗(yàn)用陶土蓋。由于陶土蓋受潮后會(huì)變形，因此在每次使用前應(yīng)挑出不符合規(guī)定的陶土蓋，高溫干熱滅菌180℃維持2 h，以除去分和殺滅污染的微生物。

（3）實(shí)驗(yàn)用牛津杯。牛津杯應(yīng)徹底清洗，避免蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)殘留牛津杯內(nèi)壁，影響樣品的滲透。使用前應(yīng)使牛津杯在無(wú)菌條件下自然冷卻后備用。使用后的牛津杯應(yīng)先超聲清洗30 min，然后使用柔軟試管刷徹底清洗牛津杯內(nèi)壁，蒸餾水沖洗干凈后晾干，180℃維持2 h高溫干熱滅菌。

2.4 試劑和培養(yǎng)基控制

（1）無(wú)菌水和PBS。采用滅菌的無(wú)菌水作為樣品的稀釋劑，同時(shí)也作為空白樣品，用以確證沒有引入污染。pH值為6.0磷酸鹽緩沖液使用滅菌蒸餾水配置，用于稀釋?duì)?內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品、青霉素標(biāo)準(zhǔn)品和舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品。

如空白樣品平皿出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果則無(wú)菌水可能被污染，應(yīng)重新配置、檢測(cè)。

（2）培養(yǎng)基。菌種培養(yǎng)使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，工作培養(yǎng)基使用抗生素Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的驗(yàn)證、配置參見《SN/T 1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則》和《SN/T 1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分培養(yǎng)基性能測(cè)試實(shí)用指南》。

2.5 操作步驟控制

2.5.1 工作菌懸液的制備

用0.85%的無(wú)菌生鮮乳將斜面上的菌苔潤(rùn)洗，使用移液管反復(fù)吹洗至均勻分散，至終濃度約為1×1010cfu/mL，菌懸液可放置4℃保存1周。菌懸液使用時(shí)可提前放置37℃水浴鍋中預(yù)熱，防止與抗生素培養(yǎng)基Ⅱ混合時(shí)造成培養(yǎng)基凝固。

2.5.2 工作平皿的制備

用于傾倒平皿底層的抗生素培養(yǎng)基Ⅱ，應(yīng)充分融化并保溫于55±5℃恒溫水浴中，傾倒底層體積為10 mL，傾倒后應(yīng)放置一段時(shí)間使瓊脂充分凝固同時(shí)表面的水蒸氣充分揮發(fā)后，加蓋備用。

用于傾倒上層的抗生素培養(yǎng)基Ⅱ，應(yīng)充分融化并保溫于55±5℃恒溫水浴中，傾倒上層體積為5 mL。水浴溫度太高影響細(xì)菌生長(zhǎng)，太低瓊脂易凝固成小顆粒，傾倒平面后培養(yǎng)基表面凸凹不平，加入牛津杯后，表面與牛津杯接觸有空隙，會(huì)產(chǎn)生漏液的現(xiàn)象。培養(yǎng)基在恒溫后加入適量菌懸液并充分混勻，避免結(jié)果產(chǎn)生誤差。

2.5.3 樣品的制備

（1）樣品應(yīng)放置-20℃以下冷凍保存，不宜反復(fù)凍融。避免因細(xì)菌污染造成的結(jié)果誤差。

（2）每次取樣時(shí)應(yīng)注意避免帶入生鮮乳中固體物質(zhì)而影響加樣和樣品的滲透。

（3）建議樣品的pH值應(yīng)控制在7.6～8.0，此條件下一些嗜酸性微生物往往不易生長(zhǎng)。

（3）樣品中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的加入順序不能改變。

（4）每次加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都應(yīng)更換新的槍頭避免交叉污染。

（5）每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入后應(yīng)及時(shí)振蕩，使其充分溶解。

（6）樣品制備好后，應(yīng)立即加樣。

（7）每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用無(wú)菌水作為空白。

2.5.3 加樣

（1）工作臺(tái)面應(yīng)保持水平，且不能震動(dòng)。

（2）牛津杯放置時(shí)牛津杯間的距離應(yīng)均一，避免影響結(jié)果測(cè)量，建議使用牛津杯放置器。牛津杯放置后盡量不要移動(dòng)。

（3）加樣時(shí)間不宜超過20 min，即從在工作平皿中加入牛津杯到加入樣品的時(shí)間。

2.5.4 培養(yǎng)

恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的底板應(yīng)保持水平，防止因底板不平而造成的漏液。培養(yǎng)溫度37±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度應(yīng)均一，避免因溫度不均勻而影響工作菌株的生長(zhǎng)，造成結(jié)果的誤差。

3 結(jié)果

使用游標(biāo)卡尺或抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)定抑菌圈的大小并記錄結(jié)果。三個(gè)平行樣的結(jié)果應(yīng)平行，0.5μg/mL的青霉素抑菌圈的大小應(yīng)控制在18～22 mm之間，過大或過小應(yīng)調(diào)整工作菌濃度。圖1為正常狀態(tài)下陰性對(duì)照水的結(jié)果，圖2為陽(yáng)性樣品的結(jié)果。

（1）當(dāng)空白結(jié)果異常時(shí)：①如果A、B、D都沒有圈，可能是青霉素標(biāo)準(zhǔn)品失效，應(yīng)該更換青霉素標(biāo)準(zhǔn)品；②如果A沒有圈，B、C、D正常，則可能是污染，應(yīng)重新檢測(cè)；③如果B沒有圈，A、C、D正常，則可能是污染，應(yīng)重新檢測(cè)；④如果C有圈，可能是β-內(nèi)酰胺酶失效，應(yīng)該更換酶儲(chǔ)備液；⑤如果D沒有圈，A、B、C正常，則可能是β-內(nèi)酰胺酶與舒巴坦比例不合適，應(yīng)調(diào)整使β-內(nèi)酰胺酶與舒巴坦恰好作用；

圖1 陰性對(duì)照水結(jié)果

圖2 陽(yáng)性奶樣結(jié)果

（2）當(dāng)空白結(jié)果正常，樣品中如果A、B和D沒有圈，可能是樣品中β-內(nèi)酰胺酶含量過高，應(yīng)將樣品稀釋。

4 討論

杯碟法檢測(cè)生鮮乳中的β-內(nèi)酰胺酶雖然操作繁瑣，但其準(zhǔn)確性卻很高，只要嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和操作步驟，均能得到滿意的檢測(cè)結(jié)果。本文主要針對(duì)生鮮乳樣品，闡述了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)控制、樣品制備和具體操作等各個(gè)環(huán)節(jié)的注意事項(xiàng)，尤其是樣品的制備和結(jié)果判讀的幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)之談可為實(shí)際操作者提供較好的參考，避免結(jié)果的誤判。

[1]沈赟,符曉梅,喬昕，等.南京市乳制品中β-內(nèi)酰胺酶類藥物殘留狀況調(diào)查[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,21(4):6-8.

[2]王榮耕.使青霉素重振雄風(fēng)的β—內(nèi)酰胺酶抑制劑[J].精細(xì)與專用化學(xué)品,2000,8(18):16-17.

[3]馬景宏,張旭,趙虹，等.沈陽(yáng)市售乳制品中β-內(nèi)酰胺酶殘留狀況初探[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2012,24(007):606-608.

[4]乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)檢驗(yàn)方法杯碟法[S].衛(wèi)生部公報(bào)，2009,7:25-28.

[5]李延華,王偉軍,張?zhí)m威等.微生物法檢測(cè)生鮮乳中β-內(nèi)酞胺類抗生素殘留的對(duì)比研究[J].中國(guó)抗生素雜志，2009,34(1):63-64.

[6]陳號(hào),馬文靜,田晉紅，等.牛奶中非法添加β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010,31(1):67-69.

[7]鄧冬云,陳萍,邵昭明，等.牛奶中β-內(nèi)酰胺酶兩種檢測(cè)方法的比較[J].職業(yè)與健康，2012,28(5):548-349.

[8]崔生輝,李景云,馬越，等.“生鮮生鮮乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測(cè)[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2007,19(2):113-116.

[9]馬玉華.關(guān)于《乳與乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢測(cè)方法—杯碟法》的經(jīng)驗(yàn)探討[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010(010):2621-2621.