直接酶解技術(shù)制備水牛乳抗氧化肽基料

李玲，唐艷，黃麗，楊攀，農(nóng)皓如，馮玲，曾慶坤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧530001）

0 引言

目前已經(jīng)從乳蛋白酶解物中分離得到多個(gè)具有抗氧化活性的肽段，這些肽段的分子量多＜3 000 u[1-4]。水牛乳與普通牛乳蛋白存在差異[5]，不同乳源蛋白的氨基酸序列不同，存在氨基酸變異現(xiàn)象[6]，水牛乳蛋白質(zhì)本身也存在多態(tài)性[7]-[8]，蛋白多態(tài)性影響氨基酸序列，最終可能影響酶解肽的功能活性[9]，有必要對(duì)水牛乳蛋白抗氧化活性肽進(jìn)行研究與開發(fā)。在前期水牛乳酪蛋白酶解工藝研究中，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的酶解能力以及酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)[10]，酶解液的苦澀味最低（極微）。但堿性蛋白酶在酶解過程中，需要調(diào)節(jié)pH值至10.5，引入的鹽分較多，堿味過重，色澤偏黃或棕色，其制備的多肽基料必須進(jìn)行脫鹽、脫色以及風(fēng)味掩蓋，才能應(yīng)用于含肽食品生產(chǎn)。為此，本文在此基礎(chǔ)上，擬通過直接酶解技術(shù)，研發(fā)1種感官良好，無(wú)需額外脫鹽、脫色工藝，可直接添加應(yīng)用的水牛乳抗氧化多肽基料。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

生水牛乳，堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，Protamex蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶，DPPH（Sigma-Aldrich），鹽酸與氫氧化鈉為食品級(jí)，其余試劑均為分析純。

8400自動(dòng)凱氏定氮儀，離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 工藝路線

水牛乳→調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（無(wú)需進(jìn)行乳清和酪蛋白分離）→殺菌、恒溫、調(diào)整pH值→添加酶進(jìn)行酶解→[持續(xù)滴加NaOH，調(diào)節(jié)pH值]→滅酶→冷卻酶解液→得到水牛乳多肽基料。

1.2.2 感官評(píng)價(jià)

產(chǎn)品感官評(píng)分主要根據(jù)酶解液的色澤、滋味、組織狀態(tài)等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。其中色澤20分，滋味50分，組織狀態(tài)30分，評(píng)分細(xì)則如表1所示。

清除DPPH自由基的能力參考李玲等[10]方法，前處理方法改進(jìn)為：將酶解液離心脫脂、去沉淀后，取清液，定容后進(jìn)行測(cè)定。水解度的計(jì)算采用pH-Stat[11]滴定法。酸溶性蛋白測(cè)定采用15%TCA-SN法。

1.2.3 酶解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 感官評(píng)分細(xì)則

采用單因素以及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白酶、加酶量、酶解時(shí)間、酶解pH值等酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表如表2所示。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 蛋白酶對(duì)酶解的影響

在各蛋白酶的最適pH值條件下（見表3），進(jìn)行酶解，選擇最適的蛋白酶。酶的選擇對(duì)酶解液的影響如表4以及圖1～圖3所示。風(fēng)味蛋白酶含有外切酶，常與其他蛋白酶復(fù)配用于多肽的制備，以降低酶解產(chǎn)物的苦味[12]，本文單獨(dú)采用風(fēng)味蛋白酶制備的酶解液，無(wú)苦澀味，水解度高，色澤較堿性蛋白酶解液淺，DPPH自由基清除率已接近堿性蛋白酶和Protamex蛋白酶酶解液，是制作直接酶解液多肽基料的優(yōu)良蛋白酶。

表3 各蛋白酶的最適酶解pH值

圖1 不同蛋白酶對(duì)水解度的影響

圖2 不同蛋白酶對(duì)色澤降低值的影響

圖3 不同蛋白酶對(duì)酶解液DPPH自由基清除率的影響

表4 不同蛋白酶得到的酶解液的感官評(píng)價(jià) 分

2.1.2 加酶量與酶解時(shí)間對(duì)酶解的影響

選擇加酶量 1 250（F-1），2 500（F-2），5 000（F-3），10 000 U/g（F-4）；評(píng)價(jià)各加酶量條件下30，60，90，120 min時(shí)各酶解液的色澤、滋味等感官，測(cè)定其蛋白水解度以及酶解液的DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖4～圖8所示。

圖4 加酶量及酶解時(shí)間對(duì)酶解液色澤的影響

圖5 加酶量及酶解時(shí)間對(duì)酶解液滋味的影響

圖6 加酶量及酶解時(shí)間對(duì)酶解液感官評(píng)分的影響

圖7 加酶量及酶解時(shí)間對(duì)酶解液DPPH清除率的影響

隨著加酶量的增加，酶解液的色澤逐漸加深，由乳白色變?yōu)槿辄S色至淺黃色。加酶量為1 250 U/g底物時(shí)，滋味評(píng)分最低，存在一定的苦澀味，加酶量大于2 500 U/g底物以后，苦澀味隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸降低甚至消失，但當(dāng)加酶量10 000 U/g底物酶解90 min以后，酶解液中出現(xiàn)一定的咸味、堿味等不良風(fēng)味，總體來(lái)說(shuō)，5 000 U/g底物在不同酶解時(shí)間的感官最好。且5 000 U/g底物下制備的酶解液，在酶解60 min以后均具備較高的DPPH自由基清除率，加酶量10 000 U/g底物酶解液雖然水解度最高，但可能因酶解過度，DPPH自由基清除率反而下降。綜合評(píng)價(jià)后，確定加酶量在5 000 U/g底物附近，酶解時(shí)間60～120 min。

圖8 加酶量及酶解時(shí)間對(duì)酶解液蛋白水解度的影響

2.1.3 pH值對(duì)酶解的影響

在加酶量5 000 U/g底物、反應(yīng)時(shí)間60 min下，對(duì)最適的酶解pH條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖9～圖11所示。pH值在6～7之間，酶解液的DPPH自由基清除率以及感官評(píng)價(jià)差異不大，但pH＞7.5以后，均略有降低。由于pH-Stat水解度的測(cè)定方法僅限于初始pH＞7.0的反應(yīng)，因此本單因素采用酸溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（15%TCA-SN）評(píng)價(jià)其蛋白的水解度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值在7.0附近，其酶解液中酸溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為3.85%，占總蛋白的93.03%。因此，確定pH值7.0為最適的酶解條件。

圖9 pH值對(duì)酶解液感官的影響

圖10 pH值對(duì)酶解液DPPH自由基清除率的影響

圖11 pH值對(duì)蛋白水解度的影響

2.1.4 pH值在線調(diào)控與否對(duì)酶解的影響

在線調(diào)控pH值，會(huì)在酶解過程中引入更多的氫氧化鈉，酶解液咸味、堿味增加，其功能活性可能會(huì)降低[13]。為此，分析了酶解過程中在線滴定調(diào)節(jié)pH值與否對(duì)酶解液的影響，控制加酶量5 000 U/g底物、反應(yīng)時(shí)間60 min，結(jié)果如表5所示。由表5可以看出，不調(diào)控pH值，雖然其酶解產(chǎn)物的水解度稍低，但DPPH清除率、色差、感官、酸溶性蛋白含量與在線調(diào)控pH值的產(chǎn)物無(wú)顯著差異（P＞0.05）。不維持pH值，可以避免過多鹽分的引入，降低咸味、堿味，因此在后續(xù)的優(yōu)化過程中，維持初始pH值7.0后，選擇不再調(diào)節(jié)pH值。

表5 pH值在線調(diào)控與否對(duì)酶解液的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在風(fēng)味蛋白酶的最適溫度50～60℃范圍內(nèi)，進(jìn)一步通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，因正交實(shí)驗(yàn)酶解原液的DPPH自由基清除率均較高，均能達(dá)到90%以上，此處采用IC50值來(lái)對(duì)比其自由基清除能力。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如表6所示。

由表6可以看出，極差分析顯示對(duì)水解度的影響主次因素為A＞B＞C，影響DPPH自由基清除率的主次因素為A＞B＞C，影響感官評(píng)價(jià)的主次因素為A＞C＞B，方差分析表明（字母不同代表存在顯著差異P＜0.05），加酶量對(duì)DPPH自由基清除率和感官評(píng)分存在顯著差異，當(dāng)加酶量＞5 000 U/g底物時(shí)，其DPPH自由基清除率顯著高于加酶量3 000 U/g底物，但當(dāng)加酶量＜5 000 U/g底物時(shí)，酶解液的感官評(píng)分更高。綜合考慮后，選擇A2B2C3，即加酶量5 000 U/g底物時(shí)，酶解時(shí)間90 min，酶解溫度60℃為最佳酶解條件。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)最優(yōu)工藝A2B2C3，進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定感官、DPPH自由基清除率、蛋白水解率等各指標(biāo)。結(jié)果如表7所示。

由表7可以看出，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的酶解液水解度22.28%，終點(diǎn)pH值為6.13，酸溶性蛋白率（15%TCA-SN）達(dá)到95.71%，感官評(píng)分達(dá)到85.6分，DPPH自由基清除IC50值為0.071±0.008 mL，色澤乳白至乳黃，無(wú)異味，含極微的咸味。

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)酶解液的各指標(biāo)測(cè)定值

3 結(jié)論

風(fēng)味蛋白酶是直接酶解技術(shù)制備水牛乳抗氧化活性肽基料的絕佳蛋白酶，通過控制加酶量5 000 U/g底物，酶解時(shí)間90 min，酶解溫度60℃，過程中不調(diào)控pH值，得到的水牛乳液態(tài)抗氧化多肽基料，酸溶性蛋白率（15%TCA-SN）達(dá)到95.71%，DPPH自由基清除IC50值為（0.071±0.008）mL，基料的色澤乳白至乳黃、無(wú)苦味、無(wú)澀味、無(wú)堿味、含極微的咸味，應(yīng)用前無(wú)需進(jìn)行脫色、脫苦、脫鹽處理，可直接在含肽食品中添加應(yīng)用。

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