蒲公英凍干提取物對體外瘤胃發(fā)酵的影響

劉雯雯， 朱清冊， 蔡 龍， 黃盛東， 張 燕， 王志博

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

蒲公英為多年生草本植物，在我國分布廣泛。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，蒲公英具有特別的藥用價值，如療腫、利尿、治療風(fēng)濕病和消炎等。蒲公英中含有許多次級植物代謝產(chǎn)物，如皂苷、類黃酮、生物堿類、酚類化合物和類固醇等（Mir等，2013）。研究表明，蒲公英乙醇提取物對葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌均具有抗菌活性（Kenny等，2014）。體外研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英根可以影響瘤胃發(fā)酵（Wencelová 等，2015）。 然而，關(guān)于蒲公英提取物調(diào)控瘤胃發(fā)酵以改善反芻動物的營養(yǎng)利用的潛在性作用的研究較少。因此本試驗研究了蒲公英凍干提取物對體外瘤胃發(fā)酵和原蟲數(shù)量的影響。

1 材料與方法

1.1 植物材料和提取物的制備 蒲公英購于當(dāng)?shù)刂胁菟幧獭１驹囼炛幸运蛘咭掖甲鳛槠压⒌奶崛∪軇?。水提取物包括冷水提取物（CAE）和水煎煮提取物（BAE）。乙醇提取物包括30%乙醇提取物（TEE）和70%乙醇提取物（SEE）。冷水提取物制備方法為在室溫下用無菌的水將粉碎的蒲公英浸泡24 h。過濾混合物以后去除蒲公英渣，將濾液凍干，所得粉末置于4℃干燥器中儲存。沸水提取方法為在室溫下以無菌的水浸泡蒲公英2 h，然后沸水提取兩次，每次1 h，之后將混合物過濾，凍干濾液和所得粉末在4℃的干燥器中存儲。蒲公英于30%或者70%的乙醇中浸泡，收集乙醇浸泡上清液，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，凍干，也于4℃條件下貯存于干燥器中。

1.2 試驗設(shè)計和發(fā)酵技術(shù) 以三只裝有瘤胃瘺管的羊作為瘤胃液的提供者。以100 mL注射器作為體外培養(yǎng)器。根據(jù)Menke等（1979）所述方法，注射器中注入30 mL培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基由10 mL瘤胃液和20 mL緩沖液組成。將粉碎的羊草（28.3%）、玉米（24.5%）、豆粕（15.5%），以精粗比50∶50的比例混合作為培養(yǎng)基。準(zhǔn)確稱量200 mg培養(yǎng)基置于100 mL的玻璃注射器中。準(zhǔn)確稱量200 mg培養(yǎng)基和5 mg蒲公英提取物（CAE、BAE、TEE和SEE）置于每個注射器中。每個采樣點(diǎn)設(shè)置3個注射器。將注射器在39℃下進(jìn)行培養(yǎng)。24 h培養(yǎng)結(jié)束后，測定培養(yǎng)物的pH、氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸和原蟲的數(shù)量。

1.3 體外發(fā)酵指標(biāo)的測定 根據(jù)Menke和Steingass（1988）描述，記錄培養(yǎng) 2、4、6、8、10、12、16、24 h后的氣體產(chǎn)生量。培養(yǎng)24 h后，立即用Sartorious（pH-Meter PB-20）酸度計測定 pH。 取2 mL的發(fā)酵液與0.4 mL的250 g/L偏磷酸混合，然后1000 r/min離心10 min。上層清液置于-20℃保存，用以測定氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸濃度。

根據(jù) Broderick和 Kang（1980）描述的方法，以UV-2401PC分光光度計測定氨態(tài)氮的濃度。根據(jù)Erwin等（1961）的方法，使用氣相色譜儀測定揮發(fā)性脂肪酸濃度。以O(shè)gimoto和Imai（1981）描述的方法測定纖毛蟲的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計分析 以SAS的混合模型對完全隨機(jī)設(shè)計的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。P≤0.05為差異顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

由圖1可見，蒲公英提取物的添加顯著提高了體外發(fā)酵的氣體產(chǎn)生量。在培養(yǎng)24 h后，冷水提取物（CAE）、沸水提取物（BAE）、30%乙醇提取物（TEE）、70%乙醇提取物（SEE）的添加使氣體產(chǎn)量分別增加了5.37、21.5%、8.06%、15.05%。

由表1可見，與對照組相比，添加蒲公英提取物顯著增加了總揮發(fā)性脂肪酸的濃度。CAE、BAE、TEE組和SEE組揮發(fā)性脂肪酸分別增加了21.66%、27.05%、19.87%、35.54%。 蒲公英提取物對乙酸和丙酸的摩爾比例無顯著影響。BAE和SEE顯著降低了丁酸的摩爾比。蒲公英提取物對乙酸與丙酸之比無顯著影響。

圖1 蒲公英提取物對體外瘤胃發(fā)酵的影響

表1 蒲公英提取物對體外培養(yǎng)24 h瘤胃揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生量的影響

由表2可見，在培養(yǎng)24 h后，通過添加蒲公英提取物降低了pH。SEE組pH最低。蒲公英提取物對氨態(tài)氮濃度無顯著影響。與對照組相比，添加沸水提取物和70%乙醇提取物顯著減少了原蟲的數(shù)量，而70%乙醇提取物組的原蟲數(shù)量比沸水提取物組的原蟲數(shù)量更低。

表2 蒲公英提取物對體外培養(yǎng)24 h瘤胃pH、氨態(tài)氮濃度以及原蟲數(shù)量的影響

3 討論

Menk 等（1979）研究表明，200 mg 飼料干物質(zhì)的24 h體外發(fā)酵產(chǎn)生的氣體量與羊體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)消化率高度相關(guān)。本研究中，蒲公英提取物的添加增加了24 h的氣體產(chǎn)生量，這表明蒲公英提取物可提高瘤胃有機(jī)物的消化率。本研究未測定氣體中二氧化碳、甲烷和氫氣濃度，進(jìn)一步的研究工作需要評價蒲公英提取物對瘤胃產(chǎn)氣中各成分的含量的影響，例如甲烷和氫氣。

揮發(fā)性脂肪酸被視為瘤胃發(fā)酵指數(shù)之一，其代表瘤胃發(fā)酵模式和營養(yǎng)消化的效率。本研究結(jié)果顯示蒲公英提取物的添加增加了揮發(fā)性脂肪酸濃度，這表明蒲公英提取物能夠提高瘤胃內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)消化率。70%乙醇提取物組的揮發(fā)性脂肪酸濃度最高，由此推斷其對瘤胃營養(yǎng)物質(zhì)消化影響最大。除了沸水提取物和70%乙醇提取物組丁酸濃度減少外。揮發(fā)性脂肪酸和乙酸與丙酸比不受蒲公英提取物的影響，這表明蒲公英提取物對瘤胃發(fā)酵模式的影響作用很小。

添加蒲公英提取物可以降低體外培養(yǎng)液的pH。這種因蒲公英提取物的添加降低pH的原因可能是由于揮發(fā)性脂肪酸濃度的增加造成的。70%乙醇提取物組的pH最小，這與其最高的揮發(fā)性脂肪酸濃度一致。70%乙醇提取物的pH超過正常范圍，原因可能是體外發(fā)酵產(chǎn)生的大量揮發(fā)性脂肪酸不能像體內(nèi)試驗?zāi)菢颖涣鑫肝?。蒲公英的莖、根和花含有高濃度的皂苷 （Mir等，2013）。因為原蟲細(xì)胞膜的甾醇可與皂苷結(jié)合，所以原蟲對皂苷敏感。本研究中，添加沸水提取物、70%乙醇提取物分別使原蟲的數(shù)量減少30.43%和54.66%，并且70%乙醇提取物組的原蟲數(shù)量低于沸水提取物。這表明沸水提取物和70%乙醇提取物含有更多皂苷，特別是70%乙醇提取物。研究表明，幾種瘤胃原蟲可以產(chǎn)生丁酸。本研究中，蒲公英提取物可以減少原蟲的數(shù)量，這可能是添加蒲公英提取物減少丁酸的原因。

4 結(jié)論

添加蒲公英凍干提取物能夠影響體外的瘤胃發(fā)酵和抑制瘤胃原蟲的生長，尤其是70%乙醇提取物效果最明顯，這表明蒲公英提取物可能有利于改善反芻動物的營養(yǎng)利用和生長性能。

[1]Broderick G A，Kang J H.Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media[J].J Dairy Sci，1980，63（1）：64～75.

[2]Erwin E，Marco G，Emery E.Volatile fatty acid analyses of blood and rumen fluid by gas chromatography[J].J Dairy Sci，1961，44（9）：1768～1771.

[3]Kenny O，Smyth T，Walsh D，et al.Investigating the potential of under-utilised plants from the Asteraceae family as a source of natural antimicrobial and antioxidant extracts[J].Food chem，2014，161：79～86.

[4]Mir M A，Sawhney S，Jassal M.Qualitative and quantitative analysis of phytochemicals of Taraxacum officinale.Wudpecker[J].J Pharm Pharmacol，2013，2（1）：1～5.

[5]Menke K，Raab L，Salewski A，et al.The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro[J].J Agr Sci，1979，93（1）：217～222.

[6]Menke K H，Steingass H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid[J].Anim Res Dev，1988，28（1）：7～55.

[7]Ogimoto K，Imai S.Atlas of rumen microbiology[M].1981.

[8]Wencelová M，Váradyová Z，Mihaliková K，et al.Rumen fermentation pattern，lipid metabolism and the microbial community of sheep fed a highconcentrate diet supplemented with a mix of medicinal plants[J].Small Ruminant Res，2015，125：64～72.