CREMτ在睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能損傷中的作用

汪清 吳詩瀟 韋思明? 潘杭麗

CREMτ在睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能損傷中的作用

汪清 吳詩瀟 韋思明? 潘杭麗

目的 環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件調(diào)控因子τ（CREMτ）是精子發(fā)生必不可少的轉(zhuǎn)錄因子。本研究探討CREMτ在睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能損傷中的作用。 方法 20只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只。對(duì)照組大鼠左側(cè)睪丸假手術(shù)。扭轉(zhuǎn)復(fù)位組大鼠左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)，1h后復(fù)位。復(fù)位后3個(gè)月，行睪丸切除術(shù)，分析睪丸CREMτ表達(dá)和生精功能。 結(jié)果 單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起同側(cè)睪丸CREMτ表達(dá)顯著降低，同側(cè)睪丸的生精功能也嚴(yán)重?fù)p傷。 結(jié)論 睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能損傷可能歸因于CREMτ表達(dá)降低。

睪丸扭轉(zhuǎn) 環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件調(diào)控因子τ 生精功能

睪丸扭轉(zhuǎn)又稱精索扭轉(zhuǎn)，在25歲以下男性的發(fā)病率為1/4000，并非少見［1］。復(fù)位是目前治療睪丸扭轉(zhuǎn)的主要方法。睪丸復(fù)位后雖然存活，但隨后出現(xiàn)睪丸萎縮，生精功能損傷。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的損傷機(jī)制仍然不明。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件調(diào)控因子τ（CREMτ）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在男性生殖細(xì)胞中的表達(dá)是其他組織的100倍，其調(diào)控著生精細(xì)胞特異基因的表達(dá)，促進(jìn)精子發(fā)生的完成［2］。本研究探討CREMτ在睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性SD大鼠（250～300g）由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自Invitrogen公司。CREMτ與β-肌動(dòng)蛋白的上、下游引物由上海生工生物工程公司合成。CREMτ抗體系Santa Cruz公司產(chǎn)品。β-肌動(dòng)蛋白抗體來源于Sigma公司。

1.2 制作大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型 20只成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為兩組，每組10只。將氯胺酮（50 mg/ kg）注入大鼠腹腔內(nèi)麻醉，所有手術(shù)在無菌條件下實(shí)行。對(duì)照組：通過左側(cè)髂腹股溝切口取出左側(cè)睪丸。用11/0絲線穿過睪丸白膜，放睪丸入陰囊，關(guān)閉切口。扭轉(zhuǎn)復(fù)位組：通過同樣的切口暴露左側(cè)睪丸。將睪丸逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)720°，在睪丸白膜與陰囊之間用11/0絲線縫合固定，保持睪丸扭轉(zhuǎn)狀態(tài)。1h后，拆除絲線，將睪丸反向旋轉(zhuǎn)到正常位置。睪丸恢復(fù)血供，仍然存活，放睪丸入陰囊內(nèi)，關(guān)閉切口。復(fù)位后3個(gè)月，大鼠行雙側(cè)睪丸切除術(shù)，分析CREMτ表達(dá)和睪丸生精功能。

1.3 評(píng)估睪丸生精功能 睪丸切下后稱重，然后制作石蠟切片，蘇木素、伊紅染色（HE染色）。在顯微鏡下觀察曲細(xì)精管，測量曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)，并行Johnsen評(píng)分。

1.4 檢測CREMτ mRNA和蛋白表達(dá)水平 用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的方法測定睪丸中CREMτ mRNA表達(dá)水平。CREMτ的上游引物是5'CCTCTGATGTGCCTGGTATT3'，下游引物是5'GCTGATTGTGCTGCATACTG3'，擴(kuò)增長度是262bp。β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，它的上游引物是5'ACTGGCATTGTGATGGACTC3'， 下游引物是5'CAGCACTGTGTTGGCATAGA3'，擴(kuò)增長度是453bp。用蛋白印跡法檢測睪丸中CREMτ蛋白表達(dá)水平。CREMτ條帶與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白的條帶密度比值代表CREMτ表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPad Prism 4.0軟件分析。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睪丸生精功能 與對(duì)照組比較扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸（扭轉(zhuǎn)復(fù)位睪丸）的重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和Johnsen評(píng)分明顯降低（P＜0.05）；兩組對(duì)側(cè)睪丸（即右側(cè)睪丸）的上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、2。

圖1 （A）兩組大鼠睪丸重量。（B）曲細(xì)精管直徑。（C）生精細(xì)胞層數(shù)。（D）Johnsen評(píng)分。斜線柱表示同側(cè)睪丸；空白柱表示對(duì)側(cè)睪丸。 與對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與同組對(duì)側(cè)睪丸比較，﹟P＜0.05。

圖 2 睪丸組織學(xué)。（A）對(duì)照組雙側(cè)睪丸和扭轉(zhuǎn)復(fù)位組對(duì)側(cè)睪丸均顯示正常的曲細(xì)精管直徑和生精細(xì)胞層數(shù)。（B）延長的精子細(xì)胞（箭頭所指處）和成熟的精子（箭所指處）。（C）扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸顯示曲細(xì)精管萎縮和生精細(xì)胞層數(shù)減少。（D）生精細(xì)胞僅發(fā)育到早期精子細(xì)胞階段，也就是圓形精子細(xì)胞階段（箭所指處），缺乏延長的精子細(xì)胞和成熟的精子。所有圖片均HE染色，圖A和C放大100倍，圖B和D放大400倍。

2.2 睪丸CREMτ表達(dá)水平 扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸的CREMτ mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組對(duì)側(cè)睪丸的CREMτ表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、4。

圖 3 對(duì)照組和扭轉(zhuǎn)兩組 （A）大鼠睪丸的CREMτ mRNA。（B）CREMτ蛋白表達(dá)水平。斜線柱表示同側(cè)睪丸；空白柱表示對(duì)側(cè)睪丸。 與對(duì)照組比較，＊P＜0.05； 與同組對(duì)側(cè)睪丸比較，﹟P＜0.05。

圖 4 兩組睪丸CREMτ表達(dá)分析。（A）用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的方法分析CREMτ mRNA表達(dá)水平。M表示DNA標(biāo)記；N表示陰性對(duì)照（用去離子水代替cDNA）；1L和1R表示對(duì)照組左側(cè)（即同側(cè)）和右側(cè)（即對(duì)側(cè)）睪丸；2L和2R表示扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)和對(duì)側(cè)睪丸。β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參照。（B）蛋白印跡法分析CREMτ蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸的CREMτ mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。兩組對(duì)側(cè)睪丸之間比較無明顯差異。

3 討論

睪丸扭轉(zhuǎn)是泌尿外科急癥，目前治療睪丸扭轉(zhuǎn)的主要方法是復(fù)位。如果睪丸扭轉(zhuǎn)后6h未治療，梗死將發(fā)生。睪丸扭轉(zhuǎn)患者即使在＜6h接受了復(fù)位手術(shù)，同側(cè)睪丸也會(huì)發(fā)生萎縮，生精功能障礙。本文動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，大鼠僅1h的睪丸扭轉(zhuǎn)，復(fù)位后雖然存活，但復(fù)位后3個(gè)月睪丸生精功能嚴(yán)重?fù)p傷。睪丸損傷的分子機(jī)制仍然不明。

CREMτ mRNA編碼CREMτ蛋白。CREMτ蛋白作為轉(zhuǎn)錄激活因子，激活生精細(xì)胞特異基因的轉(zhuǎn)錄［2］。因此，CREMτ是控制生精細(xì)胞分化的總開關(guān)。用同源重組技術(shù)使大鼠CREMτ基因突變，于是睪丸中CREMτ表達(dá)缺乏，導(dǎo)致大鼠睪丸重量減輕20%～25%，曲細(xì)精管直徑縮小20%～30%，精子發(fā)生阻斷在早期精子細(xì)胞階段，即圓形精子細(xì)胞階段，缺乏延長的精子細(xì)胞和成熟的精子［2］。由此可見，CREMτ表達(dá)對(duì)精子發(fā)生必不可少。本資料中單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起同側(cè)睪丸精子發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為睪丸重量減輕，曲細(xì)精管直徑縮小，生精細(xì)胞層數(shù)減少，Johnsen評(píng)分降低。在受損傷的睪丸，生精細(xì)胞僅發(fā)育到圓形精子細(xì)胞階段，缺乏延長的精子細(xì)胞和成熟的精子。此外，受損傷睪丸的CREMτ表達(dá)水平也顯著降低。因?yàn)椴G丸中CREMτ表達(dá)對(duì)精子發(fā)生必不可少，所以單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后同側(cè)睪丸生精功能損傷可能歸因于CREMτ表達(dá)降低。

單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是否會(huì)影響對(duì)側(cè)睪丸生精功能，目前仍有爭議。一些研究表明［3］，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位通過自身免疫、交感神經(jīng)反射等機(jī)制引起對(duì)側(cè)睪丸損傷。而其他研究者認(rèn)為［4］，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位未影響對(duì)側(cè)睪丸生精功能。本資料中，雖然單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位導(dǎo)致同側(cè)睪丸CREMτ表達(dá)水平和生精功能顯著降低，但對(duì)側(cè)睪丸無任何改變。因此，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位未導(dǎo)致對(duì)側(cè)睪丸損傷。

總之，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后，即使同側(cè)睪丸仍然存活，但它的精子發(fā)生嚴(yán)重障礙。睪丸CREMτ表達(dá)降低可能是引起生精功能損傷的原因。睪丸扭轉(zhuǎn)引起精索內(nèi)血管受壓阻塞，導(dǎo)致睪丸缺血；復(fù)位使睪丸恢復(fù)血液供應(yīng)。因此，睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的損傷是一個(gè)缺血再灌注損傷。睪丸缺血再灌注后活性氧大量產(chǎn)生?；钚匝跄苷{(diào)控許多基因的表達(dá)［5］。單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后，同側(cè)睪丸CREMτ表達(dá)降低是否由活性氧引起，目前仍然不明，需要進(jìn)一步研究來闡明。

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Objective The cAMP-responsive element modulator-τ（CREMτ）is an essential transcription factor for spermatogenesis. This study investigated role of CREMτ in spermatogenic injury after testicular torsion-detorsion. Methods Twenty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups，each containing 10 rats. Ten rats in control group underwent a sham operation of left testes. Ten rats in torsiondetorsion group received 1 hour of left testicular torsion. All rats underwent orchiectomy at 3 months after repair of torsion for analysis of testicular CREMτ expression and spermatogenesis. Results Unilateral testicular torsion-detorsion caused significant reduction in CREMτ expression in ipsilateral testes. The spermatogenesis in ipsilateral testes was also seriously injured. Conclusion Impairment of spermatogenesis after testicular torsiondetorsion may be due to reduction in CREMτ expression.

Testicular torsion cAMP-responsive element modulator-τ（CREMτ） Spermatogenesis

浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（2008B05）

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