BRCA 1、BRCA 2基因突變與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)及治療△

劉笑然 李惠平

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所乳腺腫瘤內(nèi)科，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100142

乳腺癌發(fā)病率在我國呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性健康。20世紀(jì)90年代，學(xué)者們首次發(fā)現(xiàn)BRCA1和BRCA2基因（BRCA1/2）突變與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)，但其作用機(jī)制始終存在爭議[1]。隨著研究技術(shù)和成果的不斷深化，學(xué)者們對(duì)BRCA1/2基因突變與腫瘤發(fā)生的關(guān)系逐漸形成共識(shí)，BRCA1/2蛋白在細(xì)胞分裂過程中對(duì)染色體結(jié)構(gòu)和基因序列的完整性起到監(jiān)護(hù)作用，從而預(yù)防腫瘤的發(fā)生。本文就此作一綜述。

1 BRCA 1.2在DNA修復(fù)中的作用

1.1 BRCA1.2與DNA忠實(shí)性修復(fù)

早先的研究發(fā)現(xiàn)[2]，小鼠祖系BRCA1/2基因（germline BRCA1/2）拷貝數(shù)變異，可引發(fā)早期胚胎發(fā)育阻滯，同時(shí)胚胎細(xì)胞對(duì)DNA誘變劑的敏感性增強(qiáng)[3]。當(dāng)細(xì)胞基因組受到DNA誘變劑攻擊后，BRCA1/2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與其他DNA損傷修復(fù)蛋白形成復(fù)合體，共同定位于損傷處[4]。BRCA2缺失的細(xì)胞會(huì)在增殖過程中自發(fā)地累積染色體結(jié)構(gòu)損傷，最終導(dǎo)致姐妹染色單體、三倍體及四倍體的形成。同時(shí)，BRCA2缺失還導(dǎo)致染色體分離過程紊亂，造成細(xì)胞分裂時(shí)染色體數(shù)目的異常。此外，在BRCA1/2缺失的細(xì)胞中，多數(shù)非同源染色體上的基因常發(fā)生易位、大片段缺失及融合[5]。這些結(jié)果提示，在細(xì)胞分裂時(shí)，BRCA1/2蛋白是維護(hù)染色體完整性的重要因子。

BRCA1/2缺失的細(xì)胞在有絲分裂過程中會(huì)自發(fā)地累積各種類型的突變，如DNA雙鏈斷裂（double-strand DNA break，DSB）和 子 鏈 缺 口（daughter-strand gaps，DSG）[6]。同源 DNA 重組（homologous DNA recombination，HR）是 DNA 忠實(shí)性修復(fù)的一種重要手段，即通過同源重組的方法，用正確的同源等位DNA片段糾正發(fā)生突變的DNA片段。在正常細(xì)胞分裂過程中，模板鏈上出現(xiàn)損傷會(huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制叉運(yùn)行停滯，然后細(xì)胞將錯(cuò)誤的DNA片段切斷以引發(fā)DSB并啟動(dòng)HR修復(fù)。有時(shí)DNA復(fù)制也可先行繞過復(fù)制叉停滯點(diǎn)，暫時(shí)保留DNA損傷點(diǎn)并形成DSG，而DSG同樣可以啟動(dòng)HR修復(fù)。BRCA1/2是哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)HR修復(fù)不可或缺的因子，當(dāng)BRCA1/2缺失時(shí)，DNA損傷會(huì)引發(fā)非忠實(shí)性修復(fù)，如非同源末端鏈接修復(fù)（nonhomologous end joining，NHEJ）或微同源末端鏈接修復(fù)（microhomology-mediated end joining，MHEJ）[7-8]。這兩種機(jī)制可使DNA斷裂處快速連接，但無法確保子鏈與模板鏈序列的一致性，因此，會(huì)增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 BRCA1.2在HRHR修復(fù)中的功能

在HR修復(fù)過程中，BRCA1/2蛋白通常被它們的伴侶蛋白PALB2橋接在一起[9]，但BRCA1/2發(fā)揮的功能不盡相同[10]。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，BRCA1負(fù)責(zé)在DNA損傷的初步階段發(fā)出損傷信號(hào)并啟動(dòng)HR修復(fù)；BRCA2則負(fù)責(zé)穩(wěn)定基因組復(fù)制過程中的DNA損傷區(qū)域，并招募關(guān)鍵性重組酶RAD51直接參與HR的修復(fù)過程[11]。

BRCA1蛋白通過C末端的BRCT結(jié)構(gòu)域定位到DNA的損傷位點(diǎn)并發(fā)揮功能[12]。其具體過程為：DNA發(fā)生損傷后，RAP80蛋白與DNA損傷處的泛素蛋白結(jié)合；與此同時(shí)，DNA損傷信號(hào)誘導(dǎo)橋接蛋白Abraxas的磷酸化，而BRCA1通過BRCT結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合磷酸化的Abraxas，磷酸化的Abraxas再與RAP80蛋白發(fā)生橋接，最終形成BRCA1-Abraxas-RAP80 復(fù) 合 物[13]。 此 外 ，BRCA1還可以結(jié)合DNA解旋酶BRIP1[14]或DNA修復(fù)酶CtIP[15]，從而形成多種復(fù)合物?？梢哉f，HR修復(fù)過程中，BRCT結(jié)構(gòu)域是決定BRCA1功能的重要結(jié)構(gòu)[16]。當(dāng)細(xì)胞周期在G1期時(shí)，53BP1蛋白會(huì)結(jié)合到DNA損傷的末端，同時(shí)招募其他因子以防止細(xì)胞進(jìn)行HR修復(fù)。進(jìn)入G2期后，含有BRCA1的大分子復(fù)合物通過一種未知的機(jī)制將53BP1蛋白移除，隨后5'→3'核酸內(nèi)切酶對(duì)DSB位點(diǎn)進(jìn)行剪切修飾，暴露出具有3'游離末端的單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）作為HR修復(fù)的起始底物。此外，BRCA1還負(fù)責(zé)將細(xì)胞阻滯在G2期，為HR修復(fù)提供足夠的時(shí)間[17-18]。DNA修復(fù)酶CtIP與53BP1競爭性結(jié)合BRCA1的BRCT結(jié)構(gòu)域，并參與HR修復(fù)過程中同源基因片段的置換[19]。轉(zhuǎn)基因小鼠模型的實(shí)驗(yàn)[20]證明，CtIP與BRCA1的結(jié)合是HR修復(fù)、DNA損傷應(yīng)答所必需的。

在剪切修飾后，DSB位點(diǎn)上大量的ssDNA結(jié)合蛋白R(shí)PA（replication protein A）被移除并形成裸露的ssDNA。這種移除功能正是由BRCA2來實(shí)現(xiàn)的。BRCA2與DSS1酸性蛋白結(jié)合以后，會(huì)形成一個(gè)含有寡聚核苷酸-寡聚糖重復(fù)域及DNA結(jié)合域的復(fù)合物——BRCA2-DSS1。BRCA2-DSS1能夠靶向結(jié)合DSB和DSG位點(diǎn)并移除RPA，為后續(xù)的重組酶RAD51介入提供先決條件[21]。RAD51在損傷位點(diǎn)上與ssDNA形成一個(gè)細(xì)絲狀的核蛋白復(fù)合物——RAD51-ssDNA；隨后，RAD51-ssDNA啟動(dòng)同源等位基因的聯(lián)會(huì)及置換，完成HR修復(fù)。需要指出的是，在體內(nèi)正常的環(huán)境下，RAD51傾向與雙鏈DNA（double strand DNA，dsDNA）形成穩(wěn)定的復(fù)合體，而不是ssDNA。BRCA2通過其BRC結(jié)構(gòu)域與RAD51結(jié)合后，可調(diào)節(jié)RAD51對(duì)底物DNA的選擇性，克服RAD51對(duì)dsDNA結(jié)合的偏好性。BRC結(jié)構(gòu)域由8個(gè)含有30～40個(gè)氨基酸基序的單位重復(fù)排列形成，并且在所有哺乳動(dòng)物的同源蛋白中高度保守[22]。BRCA2與RAD51結(jié)合后會(huì)穩(wěn)定RAD51-ssDNA絲狀復(fù)合物[23]，同時(shí)還抑制RAD51與dsDNA的結(jié)合[24]。這種傾向性極強(qiáng)的調(diào)控確保了RAD51-ssDNA的穩(wěn)定性，使HR修復(fù)中的同源DNA置換環(huán)節(jié)順利進(jìn)行[25]。研究發(fā)現(xiàn)[26]，BRCA2缺失的細(xì)胞長期暴露于羥基脲（dNTP類似物）中，其基因組出現(xiàn)大量停滯的DNA復(fù)制叉，并在停滯的部位頻發(fā)DSB。這說明BRCA2可以穩(wěn)定復(fù)制叉停滯部位的DNA結(jié)構(gòu)，防止DSB的發(fā)生。此外，BRCA2的C末端結(jié)構(gòu)域在HR修復(fù)過程中，還保護(hù)DNA損傷位點(diǎn)上的ssDNA不受MRE11核酸酶的降解[27]。

2 BRCA 1.2突變與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)

2.1 B RCA 1.2突變?cè)黾恿巳橄侔┌l(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)

迄今為止，分別在人類BRCA1和BRCA2基因中發(fā)現(xiàn)了1800個(gè)和2000個(gè)突變，其類型包括：內(nèi)含子突變、錯(cuò)義突變、讀碼框插入或缺失突變（breast cancer information core；www.research.nhgri.nih.gov/bic）。在BRCA1蛋白中，高致病性（highly penetrant）的錯(cuò)義突變通常會(huì)發(fā)生在RING及BRCT結(jié)構(gòu)域中[28]，這些都是BRCA1進(jìn)行DNA修復(fù)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。在BRCA2蛋白中，高致病性的錯(cuò)義突變通常發(fā)生在DNA結(jié)合域上[29]。在BRCA1中，有14%的突變由基因重排所致，而在BRCA2中的突變率約為2.6%，其中大量的重復(fù)Alu殘基是易引起基因重排的因素之一[30]。近來，一些研究開始關(guān)注BRCA1/2在特定人群中的“始祖突變”（founder mutation），如阿什克納齊（德系）猶太人的群體中，約有3%的人攜帶三種始祖突變，分別是BRCA1基因中的185delAG（約占1%）和5382insC（約占0.13%），以及BRCA2基因中的6174delT（約占1.52%）[31]。另外，在西班牙裔人群中，BRCA1基因發(fā)生ex9-12del突變的發(fā)生率約為10%[32]；在荷蘭裔人群中，也存在導(dǎo)致BRCA1基因刪除和缺失的始祖突變[33]。因此，在進(jìn)行BRCA1/2突變篩查時(shí)，有必要根據(jù)患者所屬人種及其始祖突變進(jìn)行有針對(duì)性的初篩。

流行病學(xué)調(diào)查顯示，在乳腺癌及卵巢癌中，遺傳性突變的致癌率要顯著高于始祖突變的致癌率[34]。在歐美人群中，BRCA1基因突變攜帶者在70歲時(shí)罹患乳腺癌和卵巢癌的概率分別約為57%及40%，而BRCA2基因突變的攜帶者其發(fā)病概率分別是49%及18%[35]。乳腺癌與卵巢癌患病概率的差異，一部分是由于個(gè)體間生活環(huán)境的不同，另一部分則是因?yàn)锽RCA1/2突變發(fā)生位點(diǎn)及類型的不同，如在卵巢癌中，位于BRCA1/2基因中間區(qū)域的“卵巢癌簇區(qū)域”（ovarian cancer cluster regions，OCCR）是突變的高發(fā)區(qū)，經(jīng)常出現(xiàn)無義突變和移碼突變。與位于BRCA1/2基因兩端區(qū)域的突變相比，OCCR突變導(dǎo)致卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)更高[36]。通過對(duì)19 581例BRCA1突變攜帶者和11 900例BRCA2突變攜帶者進(jìn)行篩查的研究證實(shí)，在BRCA1/2基因的中心區(qū)域發(fā)生突變時(shí)，發(fā)生卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增高，而發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)降低；相反，在BRCA1/2基因的兩端區(qū)域發(fā)生突變時(shí)，乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)將提高[36]。通過全基因組水平分析，研究者認(rèn)為造成乳腺癌及卵巢癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)差異的部分原因是患者還存在除BRCA1/2基因突變以外的其他基因組學(xué)修飾差異[37]。如果考慮到這些基因組學(xué)修飾的影響，那么BRCA1突變的攜帶者，其80歲時(shí)患乳腺癌的概率約為81%，患卵巢癌的概率不低于63%；而BRCA2突變的攜帶者在80歲時(shí)罹患乳腺癌的概率為83%[37]。

2.2 BRCA 1.2基因突變的國內(nèi)研究進(jìn)展

在國內(nèi)，研究熱點(diǎn)主要集中于乳腺癌家族遺傳性BRCA1/2基因突變。研究顯示[38]，中國人約有12.9%的家族遺傳性乳腺癌患者攜帶BRCA1/2致病性突變。北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院謝云濤研究小組采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)直接測(cè)序法，對(duì)409例家族遺傳性乳腺癌患者的BRCA1/2基因進(jìn)行了全外顯子突變檢測(cè)[39]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有患者的BRCA1/2致病性突變率為10.5%，其中年齡小于40歲的患者突變率達(dá)到23.0%。此外，ER、PR及HER2受體表達(dá)均為陰性的患者BRCA1/2基因致病性突變率為20.8%[40]。值得注意的是，在篩查出的突變位點(diǎn)中，約有50%的突變屬首次報(bào)道，提示可能為中國人群特有的“始祖突變”。與歐美篩查結(jié)果不同的是，中國人的BRCA2基因突變率高于BRCA1，而白種人的BRCA1突變較為常見[41]。上述結(jié)果表明，在乳腺癌易感基因篩查時(shí)不僅要考慮突變位點(diǎn)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的影響，更要考慮目標(biāo)人群的人種因素。因此，應(yīng)通過擴(kuò)大篩查量并建立突變文庫，以逐漸摸索出一套適用于中國人群BRCA1/2基因突變的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和體系。

3 BRCA 1.2突變與臨床治療策略的關(guān)系

3.1 BRCA 1.2突變與乳腺癌診療選擇

目前，有幾種以BRCA1/2突變?yōu)榘悬c(diǎn)的臨床診療策略，可降低女性罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)及死亡率。分別是：①早期影像學(xué)篩查；②預(yù)防性乳房切除術(shù)（risk-reducing mastectomy，RRM）和（或）預(yù)防性輸卵管-卵巢切除術(shù)（risk-reducing salpingo-oophorectomy，RRSO）；③靶向化療。

研究發(fā)現(xiàn)[42]對(duì)于BRCA1/2遺傳性突變的乳腺癌患者而言，乳腺鉬靶的早期篩查存在局限性（新發(fā)腫瘤的漏查率約為29%），確診時(shí)腫瘤已經(jīng)生長至一定程度，其中1/3還伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其中部分原因是由于BRCA1/2遺傳性突變多發(fā)于惡性程度高、生長迅速的“三陰性”乳腺癌[43]。相反，利用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術(shù)，醫(yī)生們檢出BRCA1/2突變攜帶者的數(shù)量是鉬靶及超聲檢查的兩倍[42]，并發(fā)現(xiàn)了約10%的早期乳腺癌。目前，MRI已經(jīng)作為篩查BRCA1/2突變的推薦檢測(cè)項(xiàng)目之一。當(dāng)然，檢測(cè)精確度的提高也伴隨著假陽性率的升高。研究顯示[42]，MRI結(jié)合鉬靶檢查的誤診率約為11%，而單獨(dú)使用鉬靶的誤診率只有5%。

在手術(shù)干預(yù)方面，盡管RRM使遺傳性BRCA1/2基因突變者的乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)降低了90%[44]，但由于MRI早期診斷的敏感性高，約64%的美國女性及78%的加拿大女性都選擇不采取RRM干預(yù)[45]。相反，由于血清中的檢測(cè)指標(biāo)敏感性和特異性差，RRSO正逐漸成為遺傳性BRCA1/2基因突變的卵巢癌患者的首選治療方案[46]。研究證實(shí)RRSO可以極大地降低（80%～90%）遺傳性BRCA1/2基因突變者罹患女性生殖系統(tǒng)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[47]，使乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低了約50%，其原因可能是RRSO造成了絕經(jīng)狀態(tài)提前[48]。不僅如此，RRSO還使遺傳性BRCA1/2基因突變的女性乳腺癌患者總體死亡率降低了60%?？偠灾珺RCA1/2基因突變檢查聯(lián)合RRSO的治療策略，為基因水平的“個(gè)體化治療”提供了一個(gè)很好的范例[49]。

3.2 BRCA 1.2基因突變與化療

化療干預(yù)也與BRCA1/2基因突變檢查建立了緊密的聯(lián)系。希望保乳的乳腺癌高危女性患者，可通過抗雌激素治療降低原發(fā)性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，如他莫昔芬可以使BRCA1/2基因突變者罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)降低40%～50%[50]。但是有報(bào)道提出，口服避孕藥5年以上會(huì)使BRCA1/2基因突變者罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)提高30%～50%[51]。體內(nèi)外及臨床試驗(yàn)證明，鉑類藥物是BRCA1/2基因突變腫瘤患者的理想選擇，其原理是鉑類藥物可引起DNA鏈之間的交聯(lián)，而這種損傷只能通過BRCA1/2蛋白介導(dǎo)的HR修復(fù)解除[52]。

3.3 BRCA 1.2基因突變與靶向治療

BRCA1/2基因突變的細(xì)胞還對(duì)多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］抑制劑敏感。PARP是一種參與堿基剔除修復(fù)的關(guān)鍵酶[53]，在BRCA1/2突變的細(xì)胞中，HR修復(fù)如果沒有PARP酶的參與，細(xì)胞的染色體將變得極其不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及凋亡[54]。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了PARP1抑制劑（PARP1i）在有BRCA1/2基因突變的腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌等）中的效果。目前，在四種備選的PARP1i藥物中，有一種已于2014年進(jìn)入了Ⅱ期臨床階段，預(yù)計(jì)將很快得到批準(zhǔn)并投放市場(chǎng)[55]。

3.4 PARPPARP11i i在治療BRCA1.2基因突變?nèi)橄侔┲写嬖诘膯栴}

對(duì)目前極具臨床潛力的PARP1i藥物也不能盲目樂觀[56-57]，其中有幾個(gè)問題值得深思：①小鼠實(shí)驗(yàn)證明[58]，BRCA1蛋白N末端的BARD1結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生一種常見的突變［p.Cys61Gly（c61G）］，該突變未能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)PARP1i的敏感性。這就需要明確與PARP1i敏感性相關(guān)的BRCA1/2基因突變位點(diǎn)，精確定位獲益人群。②部分腫瘤中的BRCA1/2基因?yàn)殡s合突變，因此，細(xì)胞仍具有合成正常BRCA1/2蛋白的能力，這類患者很可能無法從PARP1i中獲益。③由于BRCA1/2基因突變的細(xì)胞染色體不穩(wěn)定，極易發(fā)生基因二次突變，賦予細(xì)胞新的耐藥特性，尤其是在一些有鉑類藥物治療史的患者中，BRCA1/2的功能隨著藥物使用時(shí)間的推移，會(huì)出現(xiàn)一定程度的恢復(fù)[59]。④當(dāng)患者的正常細(xì)胞攜帶有BRCA1/2基因雜合突變時(shí)，PARP1i與蒽環(huán)類藥物或抗代謝藥物聯(lián)合應(yīng)用會(huì)引起明顯的藥物不良反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[60]，攜帶BRCA1/2基因雜合突變的非腫瘤細(xì)胞在接受PARP1i處理時(shí)，DNA損傷標(biāo)志因子γH2AX與PARP1i呈劑量依賴關(guān)系。因此，優(yōu)化PARP1i的臨床治療方案很必要，如探索PARP1i的最佳暴露劑量或者設(shè)法提高藥物靶向作用的精確性。

4 展望

過去的20年中，學(xué)者們?cè)谘芯緽RCA1/2基因的功能方面屢獲碩果，并認(rèn)識(shí)到在細(xì)胞周期活動(dòng)中，由于BRCA1/2蛋白的參與，極大地降低了腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。這些研究逐漸形成一整套成熟的科研體系，不但揭示了染色體不穩(wěn)定性誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的機(jī)制，還將BRCA1/2基因突變應(yīng)用于臨床腫瘤風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中，并以BRCA1/2基因突變?yōu)榘悬c(diǎn)研發(fā)出新的藥物及臨床診療策略。相信隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)等高通量檢測(cè)分析技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌“基因個(gè)體化治療”策略會(huì)愈加完善，使更多的患者受益。

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