利拉魯肽對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其機(jī)制研究*

李寧，王雄

利拉魯肽對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其機(jī)制研究*

李寧，王雄

目的：研究利拉魯肽對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其作用機(jī)制。

方法：分離32只SD雄性大鼠的胸主動(dòng)脈環(huán)，分成去內(nèi)皮組（n=16）和內(nèi)皮完整組（n=16）。采用離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)測(cè)定血管環(huán)張力的變化，觀察利拉魯肽（1×10-5mol/L）對(duì)去甲腎上腺素（1×10-6mol/L）預(yù)收縮的胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用。隨后內(nèi)皮完整組又分為左旋硝基精氨酸甲酯干預(yù)亞組（n=8）和格列苯脲干預(yù)亞組（n=8），分別接受一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯（1×10-4mol/L）和非特異性ATP敏感性鉀通道（KATP）抑制劑格列苯脲（1×10-5mol/L）的預(yù)處理，預(yù)處理后利拉魯肽分別作用于預(yù)處理過的去甲腎上腺素預(yù)收縮的胸主動(dòng)脈環(huán)，觀察利拉魯肽對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)作用的影響。

結(jié)果：利拉魯肽對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)的胸主動(dòng)脈環(huán)無作用。去甲腎上腺素預(yù)收縮胸主動(dòng)脈環(huán)后，當(dāng)利拉魯肽濃度達(dá)到1×10-5mol/L時(shí)，利拉魯肽對(duì)去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組胸主動(dòng)脈環(huán)均有舒張作用，但對(duì)內(nèi)皮完整組舒張作用更強(qiáng)，胸主動(dòng)脈環(huán)最大舒張幅度達(dá)17%（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)左旋硝基精氨酸甲酯和格列苯脲預(yù)處理后，左旋硝基精氨酸甲酯干預(yù)亞組利拉魯肽對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)舒張幅度為4%（P＜0.05），與預(yù)處理前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。格列苯脲干預(yù)亞組利拉魯肽對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)舒張幅度為14%（P＞0.05），與預(yù)處理前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論：利拉魯肽對(duì)去甲腎上腺素預(yù)收縮的胸主動(dòng)脈環(huán)有明顯的舒張作用，其機(jī)制與內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶有關(guān)。而KATP未能阻斷利拉魯肽的血管舒張作用。

利拉魯肽；胸主動(dòng)脈環(huán)；血管舒張；內(nèi)皮；一氧化氮合酶；ATP敏感性鉀通道

Methods: The thoracic aortic rings were isolated from 32 male SD rats and divided into 2 groups: Without endothelium group and With intact endothelium group, n=16 in each group. The contractile force of vascular ring was detected and the effect of liraglutide (1×10-5mol/L) on vasodilatation of norepinephrine (NE, 1×10-6mol/L) pre-contracted ring was observed. The aortic ring in With intact endothelium group was further divided into 2 subgroups:①the aortic ring was pre-treated by the inhibitor of nitric oxide synthase (NOS) (L-NAME at 10-4mol/L),②the aortic ring was pre-treated by non-specific ATP-sensitive-potassium (KATP) channel (Glibenclamide at 10-5mol/L), n=8 in each group. The impacts of liraglutide on those 2 sub-groups were studied.

Results: Liraglutide had no effect on isolated aortic ring at basic condition. Liraglutide at (10-5mol/L) had vasodilatation effect in both Without endothelium and With intact endothelium groups, the effect was stronger in With intact endothelium group and the maximum vasodilatation reached 17%, P＜0.05. Ⅰn both pre-treated subgroups, the effect of liraglutide on vasodilatation in sub-group① reached 4%, P＜0.05, and the effect in sub-group②

reached 14%, P＞0.05.

Conclusion: Liraglutide had obvious effect of vasodilatation on NE pre-contracted thoracic aortic ring in experimental rats, the mechanism might be related to NOS, while KATPchannel could not block the vasodilatation effect of liraglutide.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:50.)

控制血糖不僅對(duì)糖尿病本身有重要意義，而且對(duì)預(yù)防冠心病也同樣重要[1]。期望一種新型的降糖藥物，在控制血糖的同時(shí)，可以降低心血管風(fēng)險(xiǎn)，減少心血管事件發(fā)生，將給合并糖尿病的冠心病患者帶來極大的益處。美國食品藥品監(jiān)督管理局于2010年批準(zhǔn)人胰高血糖素樣肽-1類似物利拉魯肽上市，目前已有臨床應(yīng)用。利拉魯肽可以有效降低2型糖尿病患者的血糖水平，還可改善多種心血管危險(xiǎn)因素，且有輕微的血管擴(kuò)張作用，對(duì)心血管系統(tǒng)起到保護(hù)作用，合并糖尿病的心血管疾病患者獲益更多[2-13]，但其潛在的心血管保護(hù)作用機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)旨在探討利拉魯肽對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：在2013-06至2013-09期間研究納入32只SD雄性大鼠，平均體重（250±20）g，購于中國食品藥品檢定研究院。分為內(nèi)皮完整組（n=16）和去內(nèi)皮組（n=16）。隨后內(nèi)皮完整組又分為左旋硝基精氨酸甲酯干預(yù)亞組（n=8）接受一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯（1×10-4mol/L）的預(yù)處理和格列苯脲干預(yù)亞組（n=8）接受非特異性ATP敏感性鉀通道（KATP）抑制劑格列苯脲（1×10-5mol/L）的預(yù)處理，利拉魯肽分別作用于預(yù)處理過的去甲腎上腺素預(yù)收縮的胸主動(dòng)脈環(huán)。

試劑與儀器：利拉魯肽（商品名：諾和力，丹麥諾和諾德公司生產(chǎn)），去甲腎上腺素購于天津金耀氨基酸有限公司，乙酰膽堿購于上海乙基化工有限公司，左旋硝基精氨酸甲酯購于上海金穗生物科技有限公司。Krebs-Henseleit（K-H）液（NaCl 118.0 mol/ L，KCl 14.7 mol/L，KH2PO41.2 mol/L，CaCl22.5 mol/L，MgCl21.2 mol/L，NaHCO325.0 mol/L，葡萄糖 11.0 mol/ L，pH=7.4）。BL-420F計(jì)算機(jī)生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)、張力換能器都購自成都泰盟科技有限公司。數(shù)字式超級(jí)恒溫浴鍋購自常州國華電器有限公司。

胸主動(dòng)脈環(huán)制備：迅速游離大鼠胸主動(dòng)脈，置于4℃的含有95%O2和5%CO2混合氣體預(yù)飽和的K-H液中，剔除血管周圍組織，剪成3～5 mm的血管環(huán)。血管環(huán)用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，下方固定，上方以一細(xì)鋼絲連于張力換能器，橫向懸掛在10 ml K-H液的浴槽中，37℃恒溫，持續(xù)通入95% O2和5% CO2混合氣體。其靜息張力調(diào)節(jié)為 2 g，使用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄血管環(huán)張力變化。每20 min換液一次，平衡60 min。以1×10-6mol/L濃度的去甲腎上腺素預(yù)收縮兩次，以誘發(fā)血管環(huán)的最大收縮幅度，如果前后兩次最大收縮幅度差小于5%，認(rèn)為反應(yīng)性可重復(fù)。待血管穩(wěn)定后，加入1×10-6mol/L濃度的去甲腎上腺素收縮，待胸主動(dòng)脈環(huán)張力達(dá)到坪值（最大舒張幅度）后，加入梯度濃度的乙酰膽堿（1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L），觀察血管的舒張情況，來檢驗(yàn)血管內(nèi)皮完整性。去內(nèi)皮的實(shí)驗(yàn)，將修剪干凈的胸主動(dòng)脈環(huán)兩端固定，用與血管內(nèi)徑相適的棉棒從管腔擦過，連續(xù)2次。胸主動(dòng)脈環(huán)懸掛穩(wěn)定1 h后，用1×10-6mol/L濃度的去甲腎上腺素液刺激，胸主動(dòng)脈環(huán)張力達(dá)到坪值后加入乙酰膽堿（1×10-5mol/L），舒張幅度不超過收縮幅度的5%時(shí)認(rèn)為內(nèi)皮去除完全，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能測(cè)定：檢驗(yàn)內(nèi)皮完整性后，胸主動(dòng)脈環(huán)用K-H液清洗3次，至其恢復(fù)基礎(chǔ)張力。然后以去甲腎上腺素1×10-6mol/L濃度誘發(fā)胸主動(dòng)脈環(huán)最大程度收縮，按梯度濃度（1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）加入利拉魯肽后觀察血管舒張情況，以加入利拉魯肽后的血管張力幅度與去甲腎上腺素誘發(fā)最大收縮幅度之間的張力差反映血管張力的變化。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下胸主動(dòng)脈環(huán)的作用

與在基礎(chǔ)狀態(tài)下未加利拉魯肽時(shí)比，各濃度（1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）的利拉魯肽對(duì)去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組大鼠的胸主動(dòng)脈環(huán)張力均無明顯作用（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 利拉魯肽對(duì)去甲腎上腺素預(yù)收縮胸主動(dòng)脈環(huán)的作用

當(dāng)利拉魯肽濃度達(dá)到1×10-5mol/L時(shí)，利拉魯肽對(duì)去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組均有舒張作用，但對(duì)內(nèi)皮完整組舒張作用更強(qiáng)，胸主動(dòng)脈環(huán)最大舒張幅度達(dá)17%（P＜0.05）。圖1

圖1 各濃度利拉魯肽對(duì)去甲腎上腺素預(yù)收縮的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)比較

2.3 利拉魯肽對(duì)預(yù)處理的去甲腎上腺素誘導(dǎo)收縮的胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用

未經(jīng)左旋硝基精氨酸甲酯和格列苯脲預(yù)處理時(shí)，利拉魯肽1×10-5mol/L對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)血管的最大舒張幅度為17%，預(yù)處理后，左旋硝基精氨酸甲酯干預(yù)亞組利拉魯肽對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)血管舒張幅度為4%（P＜0.05），與預(yù)處理前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。格列苯脲干預(yù)亞組利拉魯肽對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)血管舒張幅度為14%（P＞0.05），與預(yù)處理前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢娮笮趸彼峒柞ヮA(yù)處理對(duì)利拉魯肽的血管舒張效應(yīng)有明顯的抑制作用，利拉魯肽是通過一氧化氮途徑舒張血管環(huán)，而格列苯脲預(yù)處理對(duì)利拉魯肽的血管舒張效應(yīng)無明顯影響。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利拉魯肽在1×10-5mol/L濃度時(shí)對(duì)去甲腎上腺素預(yù)收縮的血管環(huán)有明顯的舒張作用。利拉魯肽原濃度為1×10-3mol/L，實(shí)驗(yàn)用藥濃度僅為原藥的百分之一，說明利拉魯肽在臨床應(yīng)用中可能對(duì)血管的有微弱的舒張作用。國外已有實(shí)驗(yàn)證明，利拉魯肽對(duì)血管的舒張作用可被左旋硝基精氨酸甲酯部分抑制，原因可能與內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮途徑有關(guān)[14-16]。在本實(shí)驗(yàn)中，加入一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯后，利拉魯肽的血管舒張幅度被抑制了75%，表明利拉魯肽可能通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮而產(chǎn)生舒張血管作用，該舒張作用是通過血管內(nèi)皮一氧化氮途徑實(shí)現(xiàn)。在去內(nèi)皮的血管環(huán)中加入利拉魯肽，發(fā)現(xiàn)其仍具有血管舒張作用，但舒張作用較內(nèi)皮完整組弱，表明除了內(nèi)皮參與外，利拉魯肽還通過其他途徑舒張血管，利拉魯肽對(duì)血管的舒張作用只是部分依賴于內(nèi)皮細(xì)胞。國外亦報(bào)道，胰高血糖素樣肽-1對(duì)大鼠股動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用并不依賴于一氧化氮及血管內(nèi)皮，其機(jī)制可能為不同血管部位對(duì)利拉魯肽的血管舒張反應(yīng)有所不同[17]。本實(shí)驗(yàn)采用的是大鼠胸主動(dòng)脈，因而該血管部位的血管舒張作用可能與一氧化氮及血管內(nèi)皮作用有關(guān)。

K+通道在調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮中也具有重要作用。激活血管平滑肌上的K+通道，可引起細(xì)胞膜超級(jí)化，從而抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流，引起血管舒張。研究表明，高血糖素樣肽-1還可以通過硫化二氫、一氧化碳、非特異性ATP敏感性鉀通道以及電壓門控型鉀通道等途徑對(duì)血管產(chǎn)生舒張作用[18,19]。本實(shí)驗(yàn)采用非特異性ATP敏感性鉀通道抑制劑格列苯脲未能阻斷利拉魯肽的血管舒張作用，未能顯示非特異性ATP敏感性鉀通道抑制劑與利拉魯肽的血管舒張作用有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道不符，其可能機(jī)制為國外報(bào)道采用艾塞那肽，而本實(shí)驗(yàn)采用藥物為利拉魯肽，雖然兩種藥物均為高血糖素樣肽-1類似物，但二者可能在分子結(jié)構(gòu)和藥物作用方面仍存在一定的差別。

總之，利拉魯肽對(duì)去甲腎上腺素誘發(fā)的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)收縮具有舒張作用，其舒張作用為部分內(nèi)皮依賴性，舒張機(jī)制可能與內(nèi)皮釋放的一氧化氮合酶有關(guān)。KATP通道與利拉魯肽的血管舒張作用無關(guān)。利拉魯肽對(duì)去內(nèi)皮胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用還有待研究。

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（編輯：許 菁）

《中國循環(huán)雜志》第五屆編輯委員會(huì)通訊編委名單

通訊編委 (姓名按漢語拼音字母排序)

曹慧青 常 謙 陳 鑫 陳柯萍 程曉曙 董念國 何 奔 李虹偉

李匯華 李守軍 李 欣 劉 健 劉 蘇 劉建實(shí) 劉梅林 柳志紅

盧永昕 呂 濱 牟建軍 錢菊英 秦 勤 秦學(xué)文 宋云虎 孫寒松

孫立軍 唐蔚青 陶 軍 王海昌 王輝山 王樂豐 王偉鵬 王增武

王紅月 王 蒨 吳海英 肖穎彬 楊杰孚 楊向軍 于 波 袁晉青

張海澄 張抒揚(yáng) 趙 紅 趙連成 趙世華 鄭 哲 周建業(yè) 周京敏

朱天剛

Effect and Mechanism of Liraglutide on Vasodilatation of Thoracic Aortic Ring in Experimental Rats

LⅠ Ning, WANG Xiong.
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan (030001), Shanxi, China

Objective: To investigate the effect and mechanism of liraglutide on vasodilatation of thoracic aortic ring in experimental rats.

Liraglutide; Thoracic aortic ring; Vasodilatation; Endothelium; Nitric oxide synthase; ATP-sensitivepotassium channel

2014-05-29）

山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)2012-050）

030001 山西省太原市， 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院 心血管內(nèi)科

李寧 主治醫(yī)生 碩士研究生 研究方向：冠心病的診斷與治療 Email：4026624@163.com 通訊作者：王雄

Email：sxwangxiong@163.com

R54

A

1000-3614（2015）01-0050-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.01.014