泉州市2010-2012年豬繁殖與呼吸綜合征的病原學(xué)調(diào)查

黃長(zhǎng)春 福建省泉州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心362000

泉州市2010-2012年豬繁殖與呼吸綜合征的病原學(xué)調(diào)查

黃長(zhǎng)春 福建省泉州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心362000

為初步了解該病在泉州市的流行情況，以科學(xué)有效地防控豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），采用熒光定量RT-PCR方法對(duì)2010-2012年來(lái)自泉州市各縣（市、區(qū)）養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）的212份臨床疑似病例樣品和441份健康生豬拭子進(jìn)行PRRSV病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示54份疑似病例樣品為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為25.47%；49份拭子樣品陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11.11%。將PRRSV陽(yáng)性病料（拭子）進(jìn)行CSFV、PCV-2、PRV檢測(cè)，僅有38份樣品表現(xiàn)為PRRSV單獨(dú)感染，其他均有一種或多種其他病毒感染，占樣品檢測(cè)數(shù)的36.89%，混合感染的占樣品檢測(cè)數(shù)的63.11%。通過(guò)調(diào)查表明，PRRS感染在泉州市豬群中還普遍存在和流行，并有從單一感染向混合感染擴(kuò)大的趨勢(shì)。

豬繁殖與呼吸綜合征RT-PCR病原學(xué)調(diào)查

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬繁殖障礙和呼吸道疾病的急性、高度傳染的病毒性傳染病[1]。國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為B類傳染病，我國(guó)也將其列為二類傳染病。高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株（HP-PRRSV）引起的一種急性、高死亡率豬傳染病，我國(guó)將其列為一類傳染病[2]。

我國(guó)自1996年報(bào)道存在該病以來(lái)[3]，全國(guó)幾乎每個(gè)省（市、自治區(qū)）都報(bào)道過(guò)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大損失。福建自1997年報(bào)道以來(lái)，呈現(xiàn)蔓延及擴(kuò)大趨勢(shì)[4-6]。為了解PRRS在泉州市的流行情況，2010-2012年，通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)采樣和養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）送樣方式，采集臨床有繁殖障礙、呼吸道疾病及外觀健康無(wú)癥狀豬群的組織（拭子）樣品653份，應(yīng)用RT-PCR方法進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集采集泉州市部分臨床具有繁殖障礙或者呼吸道疾病癥狀的肺、扁桃體、淋巴結(jié)、脾等有明顯病變部位與健康部位交界的組織以及鼻腔拭子、口腔拭子等，置于-20℃保存?zhèn)溆?。另采集外觀健康正常無(wú)臨床癥狀的豬只樣品（鼻腔拭子、口腔拭子、精液或糞便拭子等），置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑總RNA極速抽提試劑盒由上海飛捷生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，試劑盒包括：RA2裂解液、洗液、洗脫液、內(nèi)套管和外套管。

病毒核酸提取試劑盒由臺(tái)灣旭基科技股份有限公司生產(chǎn)，試劑盒包括：VB裂解液、AB濃縮液、W1緩沖液、洗液、RNase-free water、內(nèi)套管和外套管。

豬藍(lán)耳病病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬瘟病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型熒光PCR檢測(cè)試劑盒、偽狂犬病病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒均由北京生科尚儀科技有限公司生產(chǎn)，試劑盒包括：RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶、Taq酶、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。

1.2.2 主要儀器Tissuelyser II組織勻漿機(jī)（德國(guó)QIAGEN）；IEC-3593離心機(jī)（美國(guó)國(guó)際設(shè)備公司）；Class Typa II生物安全柜（美國(guó)labconco公司）；Fresco 17高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）；StepOne熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；eppendorf可調(diào)單道、多道移液槍（德國(guó)）。

1.3 方法與步驟

1.3.1 待檢樣品處理

1.3.1.1 組織樣品取待檢組織樣品（病變與健康部位交界處）2.0 g放入1.5 mL eppendorf管中，加入PBS 1.0 mL，置于組織勻漿機(jī)20次/s勻漿2 min，10 000 r/min離心3 min，取上清液備用。

1.3.1.2 精液凍融2次或者超聲波裂解，以10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3.1.3 拭子等直接10 000 r/min離心1 min，取上清液備用。

1.3.2 樣品RNA提?。?）將RT-PCR檢測(cè)試劑盒的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和處理好的樣品中吸取100 μL上清液放入1.5 mL eppendorf管中，加入RA2液500 μL，充分顛倒混勻5～10次，靜置1 min。（2）將樣本裂解物全部吸入或倒入內(nèi)套管（已插在外套管中），離心1 min。（3）取出內(nèi)套管，吸去外套管中液體后放回內(nèi)套管，加入500 μL洗液，離心1 min。（4）重復(fù)步驟3再洗1次。（5）取出內(nèi)套管，吸去外套管中液體后放回內(nèi)套管，不加洗液，離心1 min。（6）將內(nèi)套管移入新的1.5 mL eppendorf管，在膜中央加入洗脫液25～50 μL。（7）室溫靜置1 min后，離心1 min，獲得總RNA。

1.3.3 樣品DNA提取按照檢測(cè)試劑使用說(shuō)明書提取。

1.3.4 PCR擴(kuò)增以RNA核酸為例，DNA核酸擴(kuò)增根據(jù)檢測(cè)試劑使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.4.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備按每15 μL RT-PCR反應(yīng)液加入0.25 μL Taq酶的量配制計(jì)算好各試劑的使用量，加入到1.5 mL eppendorf管中，充分混勻，2 000 r/min離心10 s，向每個(gè)PCR管中各分裝15 μL。

1.3.4.2 加樣（樣本處理）在各設(shè)定的PCR管中分別加入上述制備的RNA溶液10 μL，蓋緊管蓋，離心至管內(nèi)無(wú)氣泡，然后將PCR管牌號(hào)放入熒光定量RT-PCR檢測(cè)儀內(nèi)，按表1條件設(shè)置后運(yùn)行。

1.4 結(jié)果判斷試驗(yàn)成立條件：陰性對(duì)照的Ct值贏等于none；陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于28.0。Ct值為none的樣本為陰性；Ct值小于等于30.0的樣本為陽(yáng)性。Ct值大于30.0的樣本建議重做，重做結(jié)果Ct值為none為陰性，否則為陽(yáng)性。對(duì)于某些為呈現(xiàn)S型曲線，但本底較高的樣本，應(yīng)為陰性。

表1 循環(huán)條件

2 結(jié)果

2.1 部分病料（陽(yáng)性樣品）熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線結(jié)果見圖1-圖2。

圖1 病料（陽(yáng)性樣品）RT-PCR擴(kuò)增曲線a

圖2 病料（陽(yáng)性樣品）RT-PCR擴(kuò)增曲線b

2.2 臨床上存在繁殖障礙或者呼吸道疾病癥狀樣品檢測(cè)結(jié)果從表2可看出，對(duì)臨床具有繁殖障礙或呼吸道癥狀72個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）212份樣品進(jìn)行PRRSV病原檢測(cè)，結(jié)果養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）和陽(yáng)性數(shù)分別為23個(gè)和54份，陽(yáng)性率分別31.94%和25.47%。

表2 臨床有繁殖障礙或者呼吸道疾病癥狀樣品檢測(cè)結(jié)果

2.3 外觀健康豬只樣品檢測(cè)結(jié)果從表3可看出，采集的86個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）441份樣品進(jìn)行PPRSV病原檢測(cè)，有12個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）49份樣品陽(yáng)性，陽(yáng)性率為13.95%和11.11%。

表3 外觀健康豬只樣品檢測(cè)結(jié)果

從表4可看出，對(duì)35個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）103份檢測(cè)PRRSV陽(yáng)性樣品再進(jìn)行CSFV、PCV-2和PRV病原檢測(cè)，單一感染PRRSV的養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）個(gè)數(shù)和樣品陽(yáng)性數(shù)分別為10個(gè)和38份，陽(yáng)性率為28.57%和36.89%；混合感染的養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）數(shù)和樣品陽(yáng)性數(shù)分別為25個(gè)和65份，陽(yáng)性率為71.43%和63.11%。

從表5可看出，2010-2012年間，采集的158個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）653份樣品應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)PRRSV病原，陽(yáng)性數(shù)為35個(gè)和103份，陽(yáng)性率為22.15%和15.77%。

3 分析與討論

表4 PRRS與豬瘟、圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病混合感染情況

表5 樣品檢測(cè)匯總表

1）對(duì)臨床存在繁殖障礙或者呼吸道癥狀的72個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）212份病料樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果有23個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）54份PRRSV陽(yáng)性，豬場(chǎng)和病料樣品陽(yáng)性率分別31.94%和25.47%。進(jìn)一步證實(shí)了PRRSV在泉州地區(qū)還普遍存在和流行，應(yīng)引起各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）的重視。

2）對(duì)外觀無(wú)表現(xiàn)繁殖障礙或呼吸道疾病的健康豬只進(jìn)行拭子采樣，采集86戶441分樣品，結(jié)果顯示有12個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）49份樣品PRRSV陽(yáng)性，場(chǎng)（戶）數(shù)和樣品數(shù)陽(yáng)性率分別為13.95%和11.11%，表明該地區(qū)存在PRRSV感染的可能性，應(yīng)該引起養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）的高度重視。

3）對(duì)PRRSV陽(yáng)性病料再進(jìn)行豬瘟、圓環(huán)病毒2型和偽狂犬病病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示PRRSV單一感染的僅10個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）38份樣品，就分別占總數(shù)的28.57%和36.89%，而以上三種混合感染的陽(yáng)性豬場(chǎng)和陽(yáng)性病料樣品分別占71.43%和63.11%，表明疫病有從單一型往混合型蔓延的趨勢(shì)，這與楊先進(jìn)、孟祥珍等的研究基本一致[7-8]，建議在進(jìn)行防治PRRS時(shí)，要統(tǒng)籌兼顧做好其他疫病的防控工作。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].4版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2001:211-213.

[2]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1125號(hào)[EB].2008.

[3]郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV病毒的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病,1996(2):1-5.

[4]關(guān)育芳,金顏輝,柳琳,等.福建省豬繁殖與呼吸綜合征血清學(xué)調(diào)查[J].福建畜牧獸醫(yī),1997(6):4.

[5]楊小燕,李曉華,沈紹新,等.豬繁殖與呼吸綜合征血清學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2001,37(4):17-18.

[6]莊向生,車勇良,陳少鶯,等.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,22(1):135-138.

[7]楊先進(jìn).長(zhǎng)江中下游地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征流行病學(xué)調(diào)查及其在規(guī)模豬場(chǎng)的防控[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[8]孟祥珍.濰坊地區(qū)豬"高熱病"流行病學(xué)調(diào)查和防控[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

The epidemiological investigation of porcine reproductive and respiratory syndrome in Quanzhou city

Huang Changchun
(Quanzhou Animal Disease Prevention and Control Center,Fujian 362000)

To get an understanding of the current status of PRRS in Quanzhou and provide scientific basis for effectively controlling PRRS,the study employs RT-PCR to carry a test for PRRSV pathogen on 212 samples of clinically suspected cases of PRRS disease and 441 healthy pig swabs,which have been collected from farms of Luojiang district,Quangang district,Quanzhou Taishang districts and other 6 districts in Quanzhou from 2010-2012.The result shows that the positive rate among 212 samples of clinically suspected cases of PRRS disease is 25.47%,and 49 swab samples are positive,with positive rate of 11.11%.Tested on PRRSV positive disease materials(swabs)for CSFV,PCV-2,PRV,only 38 samples show PRRSV infection alone,others have more than one virus infection, accounting for 36.89%.The mixed infection rate reaches 63.11%.The reach shows that PRRS is prevalent in Quanzhou and has the tendency to develop from single infection to mixed infection.

Porcine reproductive and respiratory syndrome RT-PCR aetiological investigation

A

1003-4331（2015）06-0008-04