胞內(nèi)勞森氏菌lsaA基因克隆與序列分析

陳玉紅 鄭新添 李曉華 戴愛(ài)玲

龍巖學(xué)院福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室福建龍巖364000

胞內(nèi)勞森氏菌lsaA基因克隆與序列分析

陳玉紅 鄭新添＊李曉華 戴愛(ài)玲

龍巖學(xué)院福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室福建龍巖364000

目的：克隆并分析胞內(nèi)勞森氏菌（Lawsonia intracellularis，LI）lsaA基因，為研究該基因提供基礎(chǔ)。方法：根據(jù)已發(fā)表的LI基因組序列，設(shè)計(jì)2條引物，提取豬回腸黏膜的LI基因組，并用PCR技術(shù)擴(kuò)增lsaA基因，將其克隆、測(cè)序，進(jìn)行序列同源性、蛋白抗原性預(yù)測(cè)等分析。結(jié)果：擴(kuò)增出與702 bp引物相符的基因片段，與GenBank的序列同源性為98.4%，該基因編碼的蛋白預(yù)計(jì)具有良好的抗原性。結(jié)論：胞內(nèi)勞森菌lasA基因的成功克隆為增生性腸炎的防控提供研究基礎(chǔ)。

胞內(nèi)勞森氏菌lsaA基因序列分析抗原預(yù)測(cè)

豬增生性腸炎（Porcine proliferative enteritis，PPE）是由胞內(nèi)勞森氏菌（Lawsonia intracellularis，LI）引起的豬的接觸性傳染病。該病主要引起6～20周齡生長(zhǎng)肥育豬出現(xiàn)急性出血性下痢、間歇性下痢、食欲下降和生長(zhǎng)緩慢等臨床癥狀。自1931年首次報(bào)道以來(lái)，目前已呈全球性流行[1-2]。在我國(guó)，林紹榮等[3]于1999年證明國(guó)內(nèi)已有該病存在，造成了嚴(yán)重?fù)p失。

目前診斷方法主要有組織病理學(xué)、血清免疫學(xué)以及PCR等分子生物學(xué)診斷技術(shù)[4]。

胞內(nèi)勞森菌的lsaA基因全長(zhǎng)0.7 kb，僅含一個(gè)ORF，編碼分子質(zhì)量為27 400的蛋白質(zhì)lsaA。研究表明lsaA是胞內(nèi)勞森氏菌的表面抗原，介導(dǎo)細(xì)菌的黏附和侵襲[5]。lsaA蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為ELISA包被抗原，用于檢測(cè)組織樣品中的LI[6]。

本文設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以龍巖地區(qū)的PPE病例提取的胞內(nèi)勞森氏菌核酸為模板，擴(kuò)增LI的lsaA基因，并進(jìn)行基因克隆與序列分析，為該基因的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 病料來(lái)源龍巖地區(qū)豬場(chǎng)送檢病料，經(jīng)福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室PCR技術(shù)確診為PPE陽(yáng)性。

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上已發(fā)表的胞內(nèi)勞森氏菌基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增引物：P1：5'-GGATCCATGAAAAAAAGCATT-3'，P2：5'-AAGCTTTCAAGGAATATATTCTG-3'，上下游引物分別添加BamH I及Hind III酶切位點(diǎn)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，擴(kuò)增的目的片段約702 bp。

1.3 主要試劑Taq聚合酶、dNTPs mixture、蛋白酶K等購(gòu)于上海捷瑞生物公司；DNA膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH I、HindⅢ和克隆載體pMDl8-T等購(gòu)于寶生物（大連）工程有限公司；感受態(tài)細(xì)菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 DNA的提取刮取豬回腸黏膜，參照文獻(xiàn)[7]提取胞內(nèi)勞森氏菌DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增建立25 μL反應(yīng)體系如下：10× PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（20 mmol/L）2.0 μL，dNTPs（各10 mmol/L）1 μL，Taq聚合酶1 μL，Pl/P2（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；循環(huán)反應(yīng)95℃40 s、55℃40 s、72℃45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃10 min。PCR產(chǎn)物以1.5%凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

圖3 lsaA基因推導(dǎo)的lsaA蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

2.3 PCR產(chǎn)物克隆與酶切鑒定用PCR膠回收試劑盒回收目的DNA片段，連接到pMDl8-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，重組質(zhì)粒以BamH I、Hind III酶切鑒定，1.5%凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。

2.4 基因測(cè)序與序列分析對(duì)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，由上海生工生物工程有限公司完成。對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行同源性比較分析。并將該基因編碼的氨基酸序列應(yīng)用DNAStar軟件的Protean程序進(jìn)行分析，采用Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法，對(duì)lsaA蛋白的抗原指數(shù)、親水性、蛋白表面可及性及柔韌性進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 PCR擴(kuò)增及重組子的酶切鑒定酚-氯仿抽提后，將其總DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出約702 bp的預(yù)期片段（見(jiàn)圖1）。膠回收目的片段，連接，轉(zhuǎn)化，抽提質(zhì)粒，以BamH I和HindⅢ雙酶切，得到約2 700 bp和702 bp片段（見(jiàn)圖2）。

3.2 序列測(cè)定與核苷酸同源性比較測(cè)定序列后，所得序列長(zhǎng)度為702 bp，與預(yù)期片段大小一致（序列命名為L(zhǎng)Y1株）。序列分析表明，lsaA基因包含一個(gè)ORF，編碼233個(gè)氨基酸。用DNAstar軟件包，將LY1與GenBank上公布的胞內(nèi)菌lsaA基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，同源性為98.4%。

3.3 lsaA蛋白抗原指數(shù)、親水性、蛋白表面可及性及柔韌性預(yù)測(cè)用DNAstar軟件包Protean程序?qū)saA蛋白抗原指數(shù)（Jameson-Wolf法）、親水性（Kyte-Doolittle法）、蛋白表面可及性（Emini法）及柔韌性（Karplus-Schulz法）進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

蛋白質(zhì)的親水性、表面可及性、柔韌性等在抗原的形成方面發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)親水性＞0，抗原指數(shù)＞0，表面可及性＞1時(shí)，形成表位的可能性大，綜合以上各參數(shù)可推導(dǎo)出該蛋白的潛在抗原區(qū)位為氨基酸序列的第20-30、40-60、105-125、175-185、215-230區(qū)段，見(jiàn)表1。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖

4 討論

豬增生性腸炎是一種具有重要經(jīng)濟(jì)意義的世界性疾病，自1999年在我國(guó)發(fā)現(xiàn)該病以來(lái)，其流行性在我國(guó)豬群中已十分普遍。防控增生性腸炎的重要手段之一是疫苗免疫。目前胞內(nèi)勞森氏菌的體外培養(yǎng)較為困難，由此導(dǎo)致弱毒疫苗的制備或全細(xì)胞滅活苗的制備較難進(jìn)行，因此，對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌亞單位疫苗等的研究已成為重要課題。當(dāng)前，胞內(nèi)勞森氏菌的lsaA基因序列已被測(cè)定，并根據(jù)其編碼的蛋白制備了ELISA包被抗原[7]，在PPE血清流行病學(xué)研究中起了重要作用，但對(duì)該蛋白的免疫原性尚需進(jìn)一步研究。

表1 lsaA蛋白抗原位點(diǎn)預(yù)測(cè)

本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，采用PCR成功擴(kuò)增出約702 bp的片段，將其克隆、測(cè)序后，運(yùn)用DNAstar生物軟件包，將所得菌株（LY1）與GenBank上發(fā)表的胞內(nèi)勞森氏菌lsaA同源性進(jìn)行比較，結(jié)果表明其同源性達(dá)98.4%，具有較高的保守性。用DNAstar軟件的Protean程序?qū)saA基因編碼的lsaA蛋白抗原指數(shù)、親水性、蛋白表面可及性及柔韌性進(jìn)行預(yù)測(cè)，表明lsaA蛋白在第20-30、40-60、105-125、175-185、215-230區(qū)段具有潛在的抗原位點(diǎn)。盡管用多參數(shù)綜合預(yù)測(cè)的方案在一定程度上提高了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，但用計(jì)算機(jī)軟件分析抗原表位具有一定的局限性，研究結(jié)果只能作為確定lsaA蛋白潛在表位的參考，最終應(yīng)用效果必須用試驗(yàn)結(jié)果加以確認(rèn)。

[1]郭建超,張浩吉,白挨泉,等.豬增生性腸炎研究現(xiàn)狀與展望[J].畜牧與獸醫(yī),2012(11):95-99.

[2]Jacobson M,Fellstrom C,Jansen W M.Porcine proliferative enteropathy:an important disease with questions remaining to be solved[J].Vet J,2010,184(3):264-268.

[3]林紹榮.豬增生性腸炎的診斷與防治[C]//祖占祥.中國(guó)工廠化養(yǎng)豬二十年論文集.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社,1999: 453-457.

[4]鄭新添,楊小燕.豬增生性腸炎診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2011(4):203-206.

[5]McCluskey J,Hannigan J,Harris J D,et al.LsaA,an antigen involved in cell attachment and invasion,is expressed by Lawsonia intracellularis during infection in vitro and in vivo [J].Infect Immun,2002,70(6):2899-2907.

[6]Watarai M,Yamato Y,Horiuchi N,et al.Enzyme-linked immunosorbent assay to detect Lawsonia intracellularis in rabbits with proliferative enteropathy[J].Vet Med Sci, 2004,66(8):276-283.

[7]Jordan D M,Knittel J P,Roof M B,et al.Detection of Lawsonia intracellularis in swine using polymerase chain reaction methodology[J].J Vet Diagn Invest,1999,11(1):45-49.

關(guān)于表彰福建省科協(xié)第七屆優(yōu)秀科技期刊的決定

根據(jù)閩科協(xié)發(fā)學(xué)[2015]22號(hào)"關(guān)于申報(bào)福建省科協(xié)第七屆優(yōu)秀科技期刊獎(jiǎng)的通知"的精神，經(jīng)省科協(xié)第七屆優(yōu)秀科技期刊評(píng)審委員會(huì)評(píng)選，《應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報(bào)》等5種期刊榮獲一等獎(jiǎng)，《福建地質(zhì)》等10種期刊榮獲二等獎(jiǎng)，《福光技術(shù)》等14種期刊榮獲三等獎(jiǎng)，另外還有《福建氣象》等6種期刊獲得鼓勵(lì)獎(jiǎng)。

希望獲獎(jiǎng)刊物的主辦學(xué)會(huì)進(jìn)一步努力促進(jìn)科技期刊健康發(fā)展，努力為廣大科技工作者服務(wù)，為科技創(chuàng)新服務(wù)，真正成為在科學(xué)技術(shù)發(fā)展中不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

附∶福建省科協(xié)第七屆優(yōu)秀科技期刊獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)名單（排名不分先后）

一等獎(jiǎng)（5種）

《應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報(bào)》、《福建建筑》、《福建畜牧獸醫(yī)》、《心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志》、《學(xué)會(huì)》

二等獎(jiǎng)（10種）

《福建地質(zhì)》、《能源與環(huán)境》、《福建農(nóng)業(yè)科技》、《福建林業(yè)科技》、《福建水產(chǎn)》、《福建醫(yī)藥雜志》、《海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志》、《海峽藥學(xué)》、《情報(bào)探索》、《海峽科學(xué)》

三等獎(jiǎng)（14種）

《福光技術(shù)》、《福建電腦》、《福建農(nóng)機(jī)》、《光韻》、《水利科技》、《福建水力發(fā)電》、《福建冶金》、《化學(xué)工程與裝備》、《福建熱作科技》、《福建茶葉》、《亞熱帶水土保持》、《福建體育科技》、《福建質(zhì)量管理》、《福建稅務(wù)》

鼓勵(lì)獎(jiǎng)（6種）

《福建氣象》、《福建煙草》、《福建家具家居》、《福建醫(yī)學(xué)資料匯編》、《福建檔案》、《福建圖書(shū)館理論與實(shí)踐》

（閩科協(xié)發(fā)學(xué)[2015]29號(hào)文摘編）

Cloning and sequence analysis of lsaA gene of Lawsonia intracellularis

Chen YuhongZheng Xintian*Li Xiaohua Dai Ailing
(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Veterinary Biotechnology of Fujian Province, Longyan University,Fujian Longyan 364000)

Objective∶Cloning and sequence analysis of lsaA gene of Lawsonia intracellularis to lay the foundation for further study of the gene.Methods∶2 primers were designed to amplify Lawsonia intracellularis lsaA gene by PCR.Cloned and sequenced,the nucleotide sequence homology of this gene and protein antigenicity prediction analysis were carried out.Results∶702 bp PCR product in length were amplified,which have the sequence homology of 98.4%with that of published lsaA gene in Genbank.The protein lsaA encoded by lsaA gene is predicted to have good antigenicity by using DNAStar soft.Conclusion∶The successful cloning of Lawsonia intracellularis lsaA gene lay the foundation for the prevention and control of proliferative enteritis.

Lawsonia intracellularis lsaA gene sequence analysis antigen prediction

A

1003-4331（2015）06-0018-03

福建省教育廳A類項(xiàng)目（JA11247）資助。

＊通信作者：鄭新添（1981-），男，講師，碩士。