Kappa檢驗(yàn)比較2種豬偽狂犬病gE抗體ELISA檢測試劑盒

楊 濤 李謂娟

（1.廈門市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心361009；2.廈門市同安區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所361100）

Kappa檢驗(yàn)比較2種豬偽狂犬病gE抗體ELISA檢測試劑盒

楊 濤1李謂娟2

（1.廈門市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心361009；2.廈門市同安區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所361100）

采用2種豬偽狂犬病gE抗體ELISA檢測試劑盒分別檢測1 100份豬血清，應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性。結(jié)果顯示：2種豬偽狂犬病抗體檢測試劑盒都具有很好的重復(fù)性，檢測定性結(jié)果一致性強(qiáng)度為極好，Kappa值=0.929（95%置信區(qū)間：0.899～0.959），其符合率達(dá)98.2%，說明2種豬偽狂犬病抗體檢測試劑盒都適用于PRV gE抗體檢測。

豬偽狂犬病ELISA試劑盒Kappa檢驗(yàn)

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動(dòng)物感染的一種急性傳染病，也是嚴(yán)重危害規(guī)模養(yǎng)豬場的主要傳染病之一。豬偽狂犬病是《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》中優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的動(dòng)物疫病，并納入重點(diǎn)疫病凈化考核內(nèi)容。疫苗免疫是有效防治豬偽狂犬病的關(guān)鍵措施，目前，國內(nèi)外普遍采用偽狂犬病病毒基因缺失疫苗對該病進(jìn)行免疫預(yù)防，配套使用相應(yīng)的抗體酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒對豬血清中PRV野毒抗體進(jìn)行檢測，從而能有效監(jiān)測豬群中PRV野毒感染情況[1-2]，并據(jù)此確定下一步的PR控制和凈化措施，因此，PR抗體檢測的準(zhǔn)確性顯得尤為重要。PRV基因組為線性雙鏈DNA，可編碼70～100種蛋白質(zhì)，糖蛋白有11種，即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN，其中g(shù)E為病毒復(fù)制非必需的糖蛋白，與病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的侵襲和擴(kuò)散密切相關(guān)，是影響PRV生長的功能成分[3]，并作為標(biāo)志基因用來區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。目前市場上有不同廠家生產(chǎn)的PRV gE抗體檢測試劑盒，本研究選取2種進(jìn)口PRV gE抗體檢測試劑盒，對相同的豬血清樣品分別進(jìn)行檢測，比較2種試劑檢測的一致性。

1 材料與方法

1.1 豬血清1 100份豬血清，采自5個(gè)規(guī)模豬場。

1.2 檢測試劑豬偽狂犬病病毒gI（gE）抗體檢測試劑盒，IDEXX生產(chǎn)，批號：CL456；豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測試劑盒，ID.vet生產(chǎn)，批號：716。

1.3 檢測方法豬偽狂犬病病毒gI（gE）抗體檢測試劑盒：豬血清用試劑盒自帶稀釋液稀釋2倍后，平行加樣各2孔(100 uL/孔)，反應(yīng)同時(shí)設(shè)陽性和陰性對照各2孔。室溫下孵育60 min，洗滌3次后，加酶標(biāo)抗體100 uL，室溫下孵育20 min后再洗滌，加底物液100 uL，室溫避光顯色15 min，加50 uL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于650 nm波長測定OD值并計(jì)算S/N值（S/N＝樣品OD值/陰性對照平均OD值），其中S/N≤0.6為陽性，＞0.7為陰性，0.6＜S/N≤0.7為可疑。

豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測試劑盒：每孔加入試劑盒自帶稀釋液20 uL后平行加樣各2孔（50 uL/孔），同時(shí)加陽性和陰性對照各2孔，37℃孵育90 min，洗滌3次后，加酶標(biāo)抗體100 uL，室溫下孵育30 min后再洗滌，加底物液100 uL，室溫避光顯色15 min，加100 uL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于450 nm波長測定OD值并計(jì)算S/N%值（S/N%＝樣品OD值/陰性對照平均OD值*100），其中S/N%≤60%為陽性，＞70%為陰性，60%＜S/N≤70%為可疑。

如同份樣品檢測結(jié)果不一致，再進(jìn)行1次檢測，最終結(jié)果取2次相同的判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法檢測數(shù)據(jù)采用EXCEL處理，使用SPSS20.0做統(tǒng)計(jì)分析，對2種試劑盒檢測的結(jié)果一致性應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)(值)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為＝0.05。值≤0.40時(shí)，表明一致性較差；0.40＜值≤0.60時(shí)，表明中度一致；0.60＜值≤0.80時(shí)，表明有較高的一致性；值＞0.80，表明有極好的一致性[4]。符合率指2種試劑定性為相同結(jié)果樣本數(shù)之和除以檢測總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

對2種試劑盒的可重復(fù)性進(jìn)行評價(jià)。IDEXX豬偽狂犬病病毒gI（gE）抗體檢測結(jié)果顯示1 100份樣品中有9份樣品平行結(jié)果不一致，ID.vet gE抗體檢測結(jié)果顯示1 100份樣品中有5份樣品平行結(jié)果不一致。分析發(fā)現(xiàn)這14份樣品的檢測結(jié)果都是介于陽性和陰性之間，見表1。

表1 2種試劑檢測結(jié)果的重復(fù)性

2種試劑盒聯(lián)合檢出928份陽性和149份陰性，符合率為98.2%。根據(jù)Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值為0.929（95%置信區(qū)間：0.899～0.959），表明2種試劑盒的一致性為極好，見表2。在2種試劑檢測結(jié)果不相符的20份樣品中，差異也主要集中在判定結(jié)果位于臨界值附近的樣品,其中IDEXX的S/N值在0.436～0.873，ID.vet的S/N%值在44.3%～89.5%（見表3）。

表2v2種試劑檢測結(jié)果一致性分析

表3 20份不相符樣品檢測值比較

3 討論

Kappa檢驗(yàn)是用于檢驗(yàn)分類變量資料一致性和重現(xiàn)性的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，可以研究不同診斷方法結(jié)果間或不同觀察者評定結(jié)果間的一致性，近年人們常用Kappa分析評價(jià)2種檢測方法、2名檢驗(yàn)人員或者2種設(shè)備檢測結(jié)果的符合程度，以及用同一種方法進(jìn)行多次測定的結(jié)果能否重現(xiàn)的問題。Kappa統(tǒng)計(jì)量通常是將觀察的一致性與偶然一致性進(jìn)行比較，取值范圍介于-1和+1，如值＜0，表示由機(jī)遇所致一致率大于觀察一致性，2次檢查的結(jié)果很不一致，但在實(shí)際應(yīng)用中無意義；值＝0，表示觀察一致率完全由機(jī)遇所致，如值＞0，說明觀察一致性大于因機(jī)遇所致一致的程度，Kappa值越大，表明2種結(jié)果可靠程度越高。除了Kappa檢驗(yàn)外，國際上還可以依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）EP12-A2文件對2種定性檢測方法的一致性進(jìn)行比較[5]，按照EP12-A2文件的公式，把檢測結(jié)果定性為陰性和非陰性，計(jì)算出這2種試劑盒檢測PRV gE抗體一致程度的95%可信區(qū)間為98.1%～99.4%。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2種試劑檢測結(jié)果的差異主要集中在判定結(jié)果位于臨界值附近的樣本，而臨界值濃度是ELISA定性試驗(yàn)唯一的決定水平。臨界值濃度樣本具有多次重復(fù)檢測出現(xiàn)陰、陽性概率各占50%的特點(diǎn)，并且在臨界值濃度范圍95%區(qū)間的樣本都不易得到穩(wěn)定的檢測結(jié)果[6]，而大大超過臨界值水平的陰、陽性樣本的結(jié)果卻較為穩(wěn)定。因此，如果樣本濃度在臨界值濃度附近，會(huì)出現(xiàn)相同試劑多次檢測同一樣本結(jié)果不一致的現(xiàn)象。

目前豬場普遍使用PRV gE基因缺失弱毒苗防控PR，PRV gE抗體試劑盒的應(yīng)用為PR的控制和凈化創(chuàng)造了有利條件，并已成為PR診斷和評價(jià)PR防治效果及疫病凈化的有效手段。試驗(yàn)結(jié)果表明，2種試劑檢測結(jié)果高度一致，均可應(yīng)用于臨床檢測。

[1]鄒敏,楊旭兵,鄭輝,等.2012-2013年我國部分地區(qū)豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查[J].中國動(dòng)物檢疫,2015,32(4):1-5.

[2]占松鶴,劉華,周迎春,等.安徽省規(guī)?；N豬場豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(3):124-127.

[3]呂素芳,郭廣君,魏鳳,等.豬偽狂犬病病毒gE-/gI-/TK-多基因缺失活疫苗對豬的安全性與免疫效力研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(4):1-5.

[4]顏虹.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:21.

[5]黃嫵姣,黃憲章,莊俊華,等.CLSI EP12-A2文件在HBeAb定性檢測性能評價(jià)中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,27 (11):900-903.

[6]楊有業(yè),張秀明.臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評價(jià)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:296-312.

Application of Kappa test for evaluation of PRV gE antibody ELISA kits

Yang Tao1Li Weijuan2
（1.Xiamen Center for Animal Disease Control and Prevention,361009; 2.Tongan Animal Health Inspection Institute,Xiamen 361100）

To compare the consistency between the results of two different PRV gE antibody ELISA kits by Kappa test.1 100 swine serum samples were tested by the PRV gE antibody ELISA kits produced by two different firms.The results showed that the two kits both had good repeatability,and the consistency rate was 98.2%.The Kappa value was 0.929(95%CI∶0.899,0.959).two kits are both applicable to detect PRV gE antibody.

pseudorabies ELISA kit Kappa test

A

1003-4331（2015）06-0011-03

廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目（3502Z20154095）資助。

楊濤(1971-)，女，碩士，副研究員，主要從事動(dòng)物疫病監(jiān)測與獸醫(yī)流行病學(xué)研究。