金釵石斛DnMSI1-like基因的克隆和表達(dá)分析

陳莉莉，郭無瑕，潘 婷，劉小如，曹孟艷，王亞琴，梁 山

(廣東省植物發(fā)育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510631)

MSI1-like (MSIL)蛋白是一類在真核生物中保守的組蛋白結(jié)合蛋白，包括面包酵母中的ScMSI1，果蠅中的p55，人類的RbAp46/48，擬南芥AtMSI1 ～5，水稻OsRBAP1 ～3 等［1］.這些蛋白可直接或間接與組蛋白結(jié)合，比如在核小體組裝前結(jié)合在H4 組蛋白的螺旋-1 上，或結(jié)合于H3-H4 二聚體或四聚體上，從而調(diào)控生物體分化和發(fā)育. 單細(xì)胞酵母的MSIL 基因失去功能時(shí)沒有明顯的突變表型，而多細(xì)胞真核生物的MSIL 蛋白失去功能會(huì)引起多種特定的表型缺陷，甚至致死. 比如，模式植物擬南芥的msi4(即fve)突變體表現(xiàn)為晚花表型［2］;而msi1 表現(xiàn)出純合致死，其雜合突變體則表現(xiàn)出種子發(fā)育異常［3-4］或晚花表型［5］.超表達(dá)RbAp46 的人類細(xì)胞的腫瘤發(fā)生被抑制，暗示這一個(gè)MSIL 蛋白參與細(xì)胞增殖的調(diào)控.而在果蠅中，p55 蛋白則主要在細(xì)胞分化而不是細(xì)胞增殖的控制方面起作用.

擬南芥的AtMSI1 是多梳抑制性復(fù)合體2(Polycomb Repressive Complex 2，PRC2)的重要組分之一.PRC2 復(fù)合體在動(dòng)物、植物中保守［6-7］.在擬南芥中，PRC2 復(fù)合體使H3 組蛋白第27 位賴氨酸三甲基化，抑制靶基因的表達(dá)［7］.擬南芥至少有3 種PRC2 復(fù)合體，包括EMF2-PRC2，VRN2-PRC2 和FIS2-PRC2 復(fù)合體，參與成花轉(zhuǎn)變、花發(fā)育、受精和種子發(fā)育過程的調(diào)控［7］.與其酵母和哺乳動(dòng)物同源物類似，擬南芥AtMSI1 是一個(gè)WD-40 蛋白，其C-端含有5個(gè)連續(xù)的WD-40 結(jié)構(gòu)域，而N-端則為一個(gè)CAF1C_H4結(jié)合結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)與組蛋白的結(jié)合，參與染色質(zhì)重建和核小體的組裝［1］. 擬南芥msi 純合突變體表現(xiàn)為種子發(fā)育障礙，其雜合體也僅有一半的種子正常發(fā)育;在AtMSI1 功能被部分補(bǔ)償?shù)耐蛔凅w中，雖然種子發(fā)育良好，但開花期明顯延遲［5］. AtMSI4 即FVE蛋白被認(rèn)為是開花調(diào)控的自主途徑中的一個(gè)關(guān)鍵成分;在fve 突變中FLC 染色質(zhì)的乙?；潭忍岣撸仓觊_花被抑制［2，8-9］.

金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl.)屬于蘭科石斛屬，為觀賞和藥草兩用植物. 其花型大而美麗，常在春石斛品種培育中用作雜交母本. 金釵石斛需要經(jīng)過一段時(shí)間的低溫刺激，方可在春暖時(shí)開花［10］.本研究組在前期對(duì)金釵石斛開花調(diào)控的研究中，收集金釵石斛人工春化處理(晝夜溫度分別為16 ℃和10 ℃)不同時(shí)間的腋芽建立了cDNA 文庫并進(jìn)行文庫測序.由測序獲得的序列建立了金釵石斛的EST 數(shù)據(jù)集［11］，其中包含了MSIL 家族成員的EST 序列.根據(jù)該序列信息，本研究克隆分離了1個(gè)金釵石斛的MSIL(MSI-like)家族基因的全長cDNA序列，并對(duì)其基因表達(dá)進(jìn)行了檢測，為后續(xù)發(fā)掘其功能和培育良種花卉打下基礎(chǔ).

1 方法與材料

1.1 植物材料

金釵石斛購于云南，種植在華南師范大學(xué)國蘭中心的溫室大棚中.10月，取封頂?shù)某赡昝缭谧匀还庀逻M(jìn)行人工春化處理，晝夜溫度分別為16 ℃和10 ℃.收集不同時(shí)間處理的腋芽，液氮急凍后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 RNA 抽提和逆轉(zhuǎn)錄

金釵石斛腋芽總RNA 的抽提方法參照陳敏燕等［12］的方法. 使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit (寶生物，大連)按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.

1.3 RACE 擴(kuò)增全長cDNA

根據(jù)前期工作中收集的EST 序列庫中的MISL基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，通過3'RACE 和5'RACE進(jìn)行cDNA 末端擴(kuò)增.經(jīng)過克隆測序后，根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)特異引物，通過PCR 擴(kuò)增獲得全長cDNA 序列.

1.4 序列分析

利用NCBI 網(wǎng)站上的公共數(shù)據(jù)庫，采用BlastX搜索與金釵石斛DnMSI1-Like 蛋白的同源蛋白，在E-value ＜=10-20的搜索結(jié)果中選擇單子葉、雙子葉和被子植物進(jìn)化基部的代表性物種的同源蛋白，并將相應(yīng)的核苷酸和蛋白質(zhì)序列下載至本地. 利用LaserGene 軟件包中的Megaligne 進(jìn)行序列比對(duì)，輸出的結(jié)果被加載到TreeView 上進(jìn)行查看和分析.蛋白質(zhì)空間構(gòu)象使用SWISS-MODEL(http:∥swissmodel.expasy.org/)［13-15］預(yù)測.

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 定量PCR

采用SYBR? Premix Ex TaqTM(寶生物，大連)預(yù)制混合液，按照使用說明書加入適量的引物和0.2 μL 的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(1 μg 總RNA 作為起始模板，20 μL 的反應(yīng)體系)，在ABI7500 上通過試劑盒推薦的程序進(jìn)行定量PCR 反應(yīng). 每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù).反應(yīng)結(jié)束后，使用ABI7500 自帶的軟件進(jìn)行結(jié)果的初步分析和原始結(jié)果的輸出，用Excel 進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)果分析和作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 DnMSI1-like 的克隆和序列分析

根據(jù)前期所獲得的EST 文庫［11］中MSIL 家族成員的序列信息，通過RACE 擴(kuò)增獲得了1 條長度為1 640 bp 的MSI1-like cDNA 序列;經(jīng)DNA 序列測定及BlastX 比對(duì)表明，該序列含有長度為1 206 bp 的開放閱讀框，具有編碼擬南芥MSI1 同源蛋白質(zhì)的潛能，將該序列命名為DnMSI1-like. 根據(jù)該序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)特異引物，從金釵石斛腋芽中采用逆轉(zhuǎn)錄PCR 擴(kuò)增其編碼區(qū)，回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后測序表明所得序列長度和核苷酸順序符合預(yù)期，確定為DnMSI1-like 蛋白的編碼區(qū)序列(圖1A).

DnMSI1-Like 蛋白由401個(gè)氨基酸殘基組成(圖1C)，與擬南芥的AtMSI1 蛋白的序列一致性達(dá)到88%.蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，DnMSI1-like 的N-端含有CAF1C_H4-bd 結(jié)構(gòu)域;而與擬南芥MSI1 蛋白不同的是，DnMSI1-like 的C-端僅含有4個(gè)完整的WD40 結(jié)構(gòu)域外，最靠近C-端的是1個(gè)不完整的WD40 結(jié)構(gòu)域.這種結(jié)構(gòu)域的組織特征與擬南芥At-MSI3 蛋白類似. SWISS-MODEL(http:∥swissmodel.expasy.org/)分析表明AtMSI1 與DnMSI1-like 具有類似的空間結(jié)構(gòu)，DnMSI-like 的C-末端被隱藏在內(nèi)部，而AtMSI1 的C-端則裸露(圖1B).

圖1 DnMSI1-like cDNA 及其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)Figure 1 DnMSI1-like cDNA and the deduced protein

2.2 金釵石斛DnMSI1-like 蛋白的系統(tǒng)演化

以金釵石斛DnMSI1-like 蛋白序列為查詢項(xiàng)，通過Blastp 在NCBI 的擬南芥、水稻、酵母等物種的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫以及非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索，獲得部分單子葉、雙子葉和基部物種的同源蛋白序列;此外，從Phytozome v10 數(shù)據(jù)庫獲取了卷柏、小立碗蘚和綠色鞭毛藻的同源蛋白序列. 使用以上序列和金釵石斛DnMSI1-like 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建了以酵母(NP_010858.3)的MSIL 同源蛋白為外類群的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2). 經(jīng)分析，植物MSIL 蛋白聚為3大分枝，一枝以擬南芥的AtMSI1 為代表，一枝以擬南芥AtMSI2/3 為代表，而還有一枝則包含了擬南芥的AtMSI4/5.MSI2/3 分枝再次分枝為MSI2 和MSI3兩枝，而MSI4/5 則再分枝為MSI4 和MSI5 兩枝.MSI1 分枝包含了來自被子植物、裸子植物和蘚類、藻類的同源蛋白，表明該分枝的祖先基因遠(yuǎn)在單細(xì)胞藻類出現(xiàn)以前可能已經(jīng)存在.DnMSI1-like 與被子植物譜系的基部物種無油樟的MSIL 蛋白(XP_006836428.1)較為接近，聚在單子葉和雙子葉植物之外;在雙子葉植物中，DnMSI1-like 與洛基山耬斗菜的MSI1 蛋白(AEZ06402.1)距離較近，且與大多數(shù)雙子葉物種的MSI1 蛋白距離比與單子葉物種的同源蛋白距離較近.

圖2 DnMSI1-like 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育Figure 2 Phylogenetic analyses for DnMSI1-like protein

2.3 DnMSI1-like 表達(dá)的組織特異性

利用半定量RT-PCR 檢測結(jié)果表明，DnMSI1-like 在金釵石斛的根、花和腋芽中均有表達(dá)，而在莖、葉和愈傷組織中沒有檢測到表達(dá)產(chǎn)物(圖3A).本研究同時(shí)收集了另外一批樣品進(jìn)行了熒光定量PCR 驗(yàn)證. 結(jié)果表明，以DnUBQ 基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)時(shí)，DnMSI1-like 在根和花中的表達(dá)水平比腋芽高，分別可達(dá)到腋芽中表達(dá)量的40.6 和95.7 倍，而在莖、葉中的表達(dá)則比腋芽低2 ～4 倍(圖3B).

圖3 DnMSI1-like 基因表達(dá)的組織特異性Figure 3 The tissue-specific expression of DnSMI1-like gene

2.4 低溫誘導(dǎo)DnMSI1-like 的表達(dá)變化

在生產(chǎn)實(shí)踐中，金釵石斛在晝夜溫度16 ℃/10 ℃處理40 d 促進(jìn)提前開花. 本研究發(fā)現(xiàn)不同處理時(shí)間的腋芽樣品，DnMSI1-like 在花芽中表達(dá)變化.結(jié)果顯示:在低溫處理5 d 后，DnMSI1-like 的表達(dá)急劇上調(diào)，達(dá)到了低溫處理前的71 倍;當(dāng)處理時(shí)間延長直至30 d，其表達(dá)仍一直保持較為平穩(wěn)的高水平(圖4)，表明DnMSI1-like 基因可響應(yīng)低溫.

圖4 低溫處理時(shí)間對(duì)DnMSI1-like 在側(cè)芽中相對(duì)表達(dá)量的影響Figure 4 Effect of expression of DnMSI1-like in response to prolonged low-temperature in aillary buds of D.nobile

3 討論

MSIL 蛋白是一類含有串聯(lián)的WD40 結(jié)構(gòu)域的、在真核生物中普遍存在和保守的蛋白質(zhì). 2005年Hennig 對(duì)有限的MSIL 同源蛋白的分析表明，被子植物中的MSIL 蛋白可分為3 類，分別以擬南芥的AtMSI1、AtMSI2/3 和AtMSI4/5 為代表［1］.本研究擴(kuò)大了同源蛋白的數(shù)量，并包括了最近完成了基因組測序的被子植物基部物種無油樟的MSIL 蛋白，以果蠅MSIL 蛋白為外類群構(gòu)建的部分的被子植物MSIL 蛋白進(jìn)化樹，所得結(jié)果與Hennig［1］的類似. 通過進(jìn)一步的分析，推測MSIL 基因在被子植物中的擴(kuò)張可能來自于2個(gè)祖先基因拷貝，在被子植物出現(xiàn)前，這些祖先基因甚至可能已經(jīng)存在.在被子植物中，其中一個(gè)拷貝進(jìn)化為MSI4/5 類;而另一個(gè)拷貝則經(jīng)過了1 次復(fù)制事件后進(jìn)化為MSI 2/3 類和MSI1 2 類的祖先基因. 在MSI 4/5 分枝和MSI 2/3分枝中可能各自再經(jīng)歷過至少1 次的復(fù)制后使得MSIL 蛋白基因的拷貝數(shù)增加為至少5個(gè). 總之，MSIL 基因家族在被子植物中的進(jìn)化經(jīng)歷了至少2次的復(fù)制事件.但是，由于植物物種的基因組信息的缺乏，無法準(zhǔn)確判斷各個(gè)復(fù)制事件發(fā)生的具體時(shí)間.且這些推斷可能存在偏差，未來新的數(shù)據(jù)的加入將會(huì)有助于更準(zhǔn)確地了解MSIL 基因家族的擴(kuò)張和進(jìn)化.

本研究從金釵石斛中克隆獲得的MSIL 基因的cDNA 序列，推測編碼擬南芥的MSI1 蛋白的同源蛋白DnMSI1-like.同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，DnMSI1-like 與被子植物基部物種無油樟以及多數(shù)被分析的雙子葉植物的MSIL 蛋白的遺傳距離較為接近，而與被分析的單子葉植物的距離相對(duì)較遠(yuǎn)，這與我們對(duì)其它金釵石斛基因的進(jìn)化分析的結(jié)果一致(未發(fā)表).

本研究檢測表明，DnMSI1-like 基因在根、葉、花、花芽、假鱗莖和愈傷組織中均有表達(dá)，以花芽和花中表達(dá)較強(qiáng)，與K?hler［3］和Hennig［1］報(bào)道的擬南芥同源基因相似. 另一方面，DnMSI1-like 在根部的表達(dá)較莖、葉高. DnMSI1-like 在這些組織中的高表達(dá)是否意味著它參與這些器官的發(fā)育，需要進(jìn)一步研究.

人工春化處理的金釵石斛開花提前.當(dāng)人工春化處理(晝夜溫度16 ℃/10 ℃處理)時(shí)，在花芽中DnMSI1-like 基因表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)急劇上調(diào)，表明該基因編碼的蛋白可能強(qiáng)烈地響應(yīng)低溫刺激，為進(jìn)一步研究DnMSI1-like 基因與春化作用的相互聯(lián)系提供了線索.此外，最近研究表明擬南芥AtMSI1 通過光周期途徑調(diào)控開花［16］，研究DnMSI1-like 與光周期途徑的相互關(guān)系將有助于解釋金釵石斛開花的調(diào)控機(jī)制.

［1］Hennig L，Bouveret R，Gruissem W. MSI1-like proteins:An escort service for chromatin assembly and remodeling complexes［J］. Trends in Cell Biology，2005，15(6):295 -302.

［2］Ausín I，Alonso-Blanco C，Jarillo J A，et al. Regulation of flowering time by FVE，a retinoblastoma-associated protein［J］. Nature Genetics，2004，36(2):162 -166.

［3］K?hler C，Hennig L，Bouveret R，et al. Arabidopsis MSI1 is a component of the MEA/FIE polycomb group complex and required for seed development［J］. The EMBO Journal，2003，22(18):4804 -4814.

［4］Guitton A E，Page D R，Chambrier P，et al. Identification of new members of fertilization independent seed polycomb group pathway involved in the control of seed development in Arabidopsis thaliana［J］. Development 2004，131(12):2971 -2981.

［5］Bouveret R，Sch?nrock N，Gruissem W，et al. Regulation of flowering time by Arabidopsis MSI1［J］. Development，2006，133(9):1693 -1702.

［6］Jullien P E，Berger F. Gamete-specific epigenetic mechanisms shape genomic imprinting［J］. Current Opinion in Plant Biology，2009，12(5):637 -642.

［7］Pien S，Grossniklaus U. Polycombgroup and trithorax group proteins in Arabidopsis［J］. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression，2007，1769(5):375 -382.

［8］Koornneef M，Hanhart C，Van der Veen J. A genetic and physiological analysis of late flowering mutants in Arabidopsis thaliana［J］. Molecular and General Genetics，1991，229(1):57 -66.

［9］Sanda S L，Amasino R M. Interaction of FLC and lateflowering mutations in Arabidopsis thaliana［J］. Molecular and General Genetics，1996，251(1):69 -74.

［10］Rotor G B. Daylength and temperature in relation to growth and flowering of orchids［M］. USA:Cornell University，1952.

［11］Liang S，Ye Q S，Li R H，et al. Transcriptional regulations on the low-temperature-induced floral transition in an orchidaceae species，Dendrobium nobile:An expressed sequence tags analysis［J］. Comparative and Functional Genomics，2012:757801. doi:10.1155/2012/757801.

［12］陳敏燕，郭無瑕，劉小如，等. 金釵石斛SEP3-like 基因的克隆及其在春化過程中的表達(dá)分析［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38(8):1579 -1588.Chen M Y，Guo W X，Liu X R，et al. A SEP3-like Gene in Dendrobium nobile(DnSEP3-like):Cloning，Characterization and Vernalization-induced Transcription Patterns［J］. Acta Horticulturae Sinica，2011，38(8):1579-1588.

［13］Arnold K，Bordoli L，Kopp J，et al. The SWISS-MODEL workspace:A web-based environment for protein structure homology modelling［J］. Bioinformatics，2006，22(2):195 -201.

［14］Benkert P，Biasini M，Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models［J］. Bioinformatics，2011，27(3):343 -350.

［15］Biasini M，Bienert S，Waterhouse A，et al. SWISSMODEL:Modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information［J］. Nucleic Acids Research，2014，42:252 -258.

［16］Steinbach Y，Hennig L. Arabidopsis MSI1 functions in photoperiodic flowering time control［J］. Frontiers in Plant Science，2014，5:77. doi:10. 3389/fpls. 2014.00077.