HPLC法測定帕瑞昔布鈉中有關(guān)物質(zhì)的方法研究

聶忠莉，郭兆元，蕭茂玲，王曉玲，張　勇，郭　瑞，葉　丁

（1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都大學(xué)四川抗生素工業(yè)研究所，四川 成都 610106；3.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610041）

HPLC法測定帕瑞昔布鈉中有關(guān)物質(zhì)的方法研究

聶忠莉1，郭兆元2，蕭茂玲1，王曉玲3，張勇3，郭瑞3，葉丁3

（1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都大學(xué)四川抗生素工業(yè)研究所，四川 成都 610106；3.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610041）

建立以高效液相色譜法（HPLC）測定帕瑞昔布鈉中有關(guān)物質(zhì)的方法。色譜柱為C18柱（4.6mm×250mm×5μm），乙腈-0.01mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（47∶53，ν∶ν）為流動相，檢測波長為215nm，柱溫40℃。經(jīng)過優(yōu)化色譜條件后，帕瑞昔布鈉峰與6個已知雜質(zhì)峰均可達到基線分離，樣品主峰及各雜質(zhì)的色譜峰的靈敏度和分離度均滿足測定要求。采用HPLC法測定帕瑞昔布鈉中的有關(guān)物質(zhì)，專屬性強，方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

HPLC法；帕瑞昔布鈉；雜質(zhì)；代地昔布

0　引　言

帕瑞昔布鈉是一種治療術(shù)后短期疼痛臨床用藥[1]。帕瑞昔布鈉是伐地昔布的非活性前體藥物，為水溶性藥物。水解后，生成伐地昔布[4-（5-甲基-3-苯基異惡唑-4-基）苯磺酰胺]和丙酸，能高選擇性地抑制COX-2[2]，在發(fā)揮良好鎮(zhèn)痛及抗炎作用[3]的同時，不影響胃腸道粘膜、血小板聚集及腎臟的功能。大量研究表明，帕瑞昔布鈉用于骨科[4]、普外科[5]、婦科[6]等臨床各科手術(shù)的術(shù)后鎮(zhèn)痛效果良好[7]，副作用較小，為需要經(jīng)過非胃腸道給藥的手術(shù)期患者帶來了福音。

分析本品的合成工藝，并參考相關(guān)文獻[8-9]及專利[10]，本品中可能存在的有機雜質(zhì)是：異噁唑（起始物料A）﹑中間體A、伐地昔布（中間體B）；雜質(zhì)A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F、G、H、I、J、K、L。本文采用高效液相色譜法對本品中可能存在的雜質(zhì)E、H、J、K、L、伐地昔布（中間體B）和異噁唑（起始物料A）等有關(guān)物質(zhì)進行檢測和方法學(xué)驗證研究，結(jié)果顯示此方法專屬性強，靈敏度高，適用于帕瑞昔布鈉中有關(guān)物質(zhì)的控制。其余的雜質(zhì)不在本文研究之內(nèi)。

1　儀器與試藥

儀器：Series 1500高效液相色譜儀；UV759CRT紫外可見分光光度計；BP 210D電子分析天平；KH5200E型超聲波清洗器（頻率40 kHz，超聲時長15 min）；pHS-3C酸度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠）。

試藥：帕瑞昔布鈉（工作對照品批號：130801；測定樣品批號：130903、130904、130905，成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，131101、131102、131103，成都通德藥業(yè)有限公司）；異噁唑、伐地昔布、雜質(zhì)E、雜質(zhì)J、雜質(zhì)K、雜質(zhì)H、雜質(zhì)L對照品由成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司研制；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1供試品溶液

取帕瑞昔布鈉樣品適量，精密稱定，用稀釋劑乙腈-水（47∶53，ν∶ν）制成0.4mg/mL的供試品溶液。

2.1.2對照品溶液

精密量取供試品溶液適量，加稀釋劑稀釋至0.4μg/mL作為對照溶液。

取異噁唑、伐地昔布、雜質(zhì)E、J、K、H、L對照品與帕瑞昔布鈉，工作對照品各適量，精密稱定，用稀釋劑乙腈-水（47∶53，ν∶ν）溶解并稀釋制成每1mL中含帕瑞昔布鈉0.4mg、各雜質(zhì)均為0.4μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2測定波長的選擇

取異噁唑、伐地昔布、雜質(zhì)E、J、K、H、L對照品與帕瑞昔布鈉對照品各適量，分別用乙腈-水（40∶60，ν∶ν）配置成0.02 mg/mL的溶液，照紫外-可見分光光度法[11]在200～400 nm范圍內(nèi)掃描[12]，結(jié)果帕瑞昔布鈉、中間體及各雜質(zhì)均具有較大的紫外末端吸收，最終選擇215 nm作為本品有關(guān)物質(zhì)檢測波長。

表1　帕瑞昔布鈉有關(guān)物質(zhì)分析方法色譜條件比較

圖1　帕瑞昔布鈉及雜質(zhì)對照品定位色譜圖

2.3色譜條件的確定

參照注射用帕瑞昔布鈉進口注冊標(biāo)準(zhǔn)[13]，對帕瑞昔布鈉有關(guān)物質(zhì)進行分離考察，并對色譜條件進行不斷優(yōu)化，其結(jié)果見表1。

因此，本文選用色譜條件為C18柱（4.6 mm× 250mm×5μm），乙腈-0.01mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（47∶53，ν∶ν）為流動相，檢測波長為215nm，柱溫40℃。

2.4系統(tǒng)適用性試驗及定位試驗

取2.1.2項雜質(zhì)對照品溶液10μL按2.3項下條件進樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明帕瑞昔布鈉主峰與雜質(zhì)對照品的雜質(zhì)峰（包含雜質(zhì)E、伐地昔布、J、K、H、L、異噁唑）以及溶劑空白之間的分離度均在2.4以上，能完全分離；其出峰結(jié)果見圖1。

表2　有關(guān)物質(zhì)強降解試驗結(jié)果

圖2　帕瑞昔布鈉樣品的專屬性試驗色譜圖

2.5強降解試驗

分別取帕瑞昔布鈉樣品適量，對其進行酸、堿、氧化、高溫及紫外光照等強降解試驗，按2.3項下條件進行測定，結(jié)果見表2和圖2。

由上述實驗結(jié)果可知：帕瑞昔布鈉對熱、酸、堿穩(wěn)定，雜質(zhì)基本無變化；對紫外燈光和氧化均不穩(wěn)定，在不同的降解條件下，產(chǎn)生的雜質(zhì)及雜質(zhì)的變化量也不同；但最主要的變化量是氧化降解條件下，已知雜質(zhì)中間體B（伐地昔布）達到了39.6%。在各降解條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰，以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均達到0.9999，雜質(zhì)峰峰純度基本均達0.99以上，峰降解平衡在95%～105%之間，結(jié)果表明該方法專屬性良好，能檢測出帕瑞昔布鈉在儲藏和運輸過程的極端條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。

2.6檢測限、定量限

取2.1.2帕瑞昔布鈉對照品溶液適量，加乙腈-水（47∶53，ν∶ν）稀釋至一定濃度，取此溶液適量按2.3項方法進樣，記錄色譜圖，同時走空白基線，以儀器基線噪音3倍峰高作為檢測限（S/N≥3），儀器基線噪音10倍峰高作為定量限（S/N≥10），得各雜質(zhì)的定量限與檢測限如表3所示。

表3　帕瑞昔布鈉有關(guān)物質(zhì)檢測限、定量限試驗

2.7線性

精密稱取帕瑞昔布鈉及各雜質(zhì)對照品適量，用乙腈-水（47∶53，ν∶ν）溶解并稀釋至適宜濃度，精密量取各溶液10μL按2.3方法檢測，記錄色譜圖。以濃度-峰面積做曲線，結(jié)果表明：在4.00～497.14μg/mL范圍內(nèi)，帕瑞昔布鈉線性方程為Y=32.31x+16.04；r2=0.999 4；在0.10～5.0 μg/mL范圍內(nèi)，雜質(zhì)E（Y=44.66x-1.60；r2=0.998 4）、伐地昔布（Y=42.397x+ 1.49；r2=0.9997）、雜質(zhì)J（Y=43.42x+1.33；r2=0.9997）、雜質(zhì)K（Y=34.60x+1.1；r2=0.9997）、雜質(zhì)H（Y=21.19x+ 3.64；r2=0.9912）、雜質(zhì)L（Y=35.20x+1.14；r2=0.9998）、異噁唑（Y=42.90x+1.09；r2=0.9998）色譜峰面積與其濃度均有良好的線性關(guān)系。

2.8重復(fù)性試驗和中間精密度

6份帕瑞昔布鈉樣品，分別稱取一定量并加乙腈-水（47∶53，ν∶ν）溶解稀釋制成0.4mg/mL的供試品溶液，取此溶液適量按2.3項方法進樣，記錄色譜圖。6份樣品中，未知雜質(zhì)按未加校正因子的自身對照法計算含量，已知雜質(zhì)按峰面積外標(biāo)法計算含量，結(jié)果顯示6份樣品均只檢出伐地昔布和雜質(zhì)K兩個雜質(zhì)，RSD分別為：4.77%、3.46%；其他雜質(zhì)均未檢出，重復(fù)性良好。

由不同人員在不同時間、不同儀器上對同一批號樣品測定12次，各雜質(zhì)的平均含量分別為：伐地昔布0.0128%、雜質(zhì)K 0.0154%、總雜質(zhì)0.0282%；RSD分別為：伐地昔布4.91%、雜質(zhì)K 4.75%、總雜質(zhì)4.34%，中間精密度良好。

2.9供試品溶液穩(wěn)定性

取2.1.2項下對照品溶液，在室溫下分別放置0，2，4，8，16，24h，按2.3方法檢測，溶液在24h內(nèi)都未產(chǎn)生任何新的雜質(zhì)，如表4所示。

表4　帕瑞昔布鈉有關(guān)物質(zhì)穩(wěn)定性試驗（n=6）

2.10回收率試驗

精密稱定帕瑞昔布鈉（130801）10mg（共10份）分別加入上述50%對照品溶液、100%對照品溶液、150%對照品溶液1.0mL各3份使樣品溶解，分別作為50%、100%、150%的供試品溶液；剩余一份加入乙腈-水（47∶53，ν∶ν）使溶解，作為供試樣品溶液。分別取上述對照品溶液、供試品溶液、供試樣品溶液按2.3項方法進樣，記錄色譜圖，回收率結(jié)果見表5。各雜質(zhì)回收率良好。

表5　帕瑞昔布鈉有關(guān)物質(zhì)平均回收率

2.11耐用性

在檢測波長、柱溫、流動相流速、pH值、流動相比例發(fā)生微小變化的情況下，按2.3方法檢測，樣品中雜質(zhì)個數(shù)和雜質(zhì)量，以及各成分峰之間的分離度與原條件幾乎無變化；但當(dāng)色譜柱發(fā)生改變時，雜質(zhì)H的出峰保留時間發(fā)生變化，且變化較大，但測定雜質(zhì)含量變化不是很大，由此可證明在色譜柱不發(fā)生變化的情況下，本方法的耐用性良好；另從樣品雜質(zhì)檢測情況看，各批樣品中均未檢測出雜質(zhì)H，若本品中不存在雜質(zhì)H的情況下，色譜柱的耐用性也可視為良好。

3　結(jié)果與討論

3.1有關(guān)物質(zhì)檢測進樣濃度的確定

根據(jù)化學(xué)藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則對有關(guān)物質(zhì)限度的要求，原料的雜質(zhì)報告限度、鑒定限度、質(zhì)控限度分別為0.05%、0.10%、0.15%（每日最大劑量＜2g），本品每日的最大劑量為80 mg帕瑞昔布，因此為了保證0.05%的雜質(zhì)能檢出，根據(jù)本品的檢測限試驗結(jié)果，以進樣10μL計算，有關(guān)物質(zhì)檢查的濃度至少應(yīng)為0.43ng/10 μL/0.05%/103=0.086 mg/mL，參照帕瑞昔布鈉進口注冊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)檢測的進樣濃度及本品制劑規(guī)格，確定有關(guān)物質(zhì)檢測濃度為0.4mg/mL，進樣量為10μL。

3.2色譜圖記錄時間的確定

由破壞試驗結(jié)果可知，已知雜質(zhì)峰及其破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)峰均在主峰的3.5倍保留時間內(nèi)，故確定供試品溶液色譜圖記錄時間為主峰保留時間的3.5倍。

4　結(jié)束語

通過上述實驗結(jié)果表明：在優(yōu)化的帕瑞昔布鈉有關(guān)物質(zhì)色譜條件下，破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰，以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均達到0.999 9，雜質(zhì)峰峰純度基本為0.99以上；各破壞樣品的物料平衡均在95%～105%之間，說明該方法專屬性良好，能檢測出本品在儲藏和運輸過程的極端條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)。

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Research on HPLC method for related substances in parecoxib sodium

NIE Zhongli1，GUO Zhaoyuan2，XIAO Maoling1，WANG Xiaoling3，ZHANG Yong3，GUO Rui3，YE Ding3
（1.School of Pharmacy and Bioengineering，Chengdu University，Chengdu 610106，China；2.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University，Chengdu 610106，China；3.Chengdu Climb Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Chengdu 610041，China）

To determine related substances in parecoxib sodium with high performance liquid chromatograph（HPLC）.C18 column has been used as filler（4.6 mm×250 mm×5 μm）and acetonitrile-0.01 mol/L ammonium dihydrogen phosphate（adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid）（47∶53，ν∶ν）as mobile phase.The detection wavelength was set at 215nm and the column temperature 40℃.After the optimization of chromatographic conditions，the parecoxib sodium peak and 6 known impurity peaks meet the requirement of baseline separation.The sensitivity and resolution of the main peak of the samples and the chromatographic peak of all the impurities are both acceptable.The HPLC method is specific and reliable.

HPLC method；parecoxib sodium；impurities；valdecoxib

A

1674-5124（2015）12-0054-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.12.014

2015-04-01；

2015-06-06

聶忠莉（1966-），女，副主任藥師，主要從事藥物分析研究。