HPLC法測(cè)定清熱暗瘡?fù)柚芯G原酸的含量

岳 莉，戚繼紅，沈 偉

(安徽省淮北市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽淮北 235000)

清熱暗瘡?fù)枋怯山疸y花、大黃浸膏、穿心蓮浸膏、人工牛黃、蒲公英浸膏、珍珠層粉、山豆根浸膏、甘草、梔子浸膏等九味中藥制成的中藥制劑，具有清熱解毒，涼血散瘀，瀉火通腑之功效，臨床用于治療痤瘡(粉刺)，癤痛。該產(chǎn)品收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第六冊(cè)，原標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有有效成分的含量測(cè)定。金銀花為其處方中君藥之一，主要成分為綠原酸，具有抗菌、抗病毒活性。為了有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，經(jīng)參考有關(guān)文獻(xiàn)及《中國(guó)藥典》2010年版一部［1］方法，本文采用高效液相色譜法測(cè)定金銀花中綠原酸的含量，用于本制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 Thermo U-3000 HPLC色譜系統(tǒng);ChromeleonTM7工作站;Thermo DAD-3000檢測(cè)器;超聲波處理器(濟(jì)寧奧波超聲電氣有限公司，批號(hào):JAC-300);Mettler AE-240電子分析天平(0.1 mg;0.01 mg)。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110753-200413，供含量測(cè)定用);清熱暗瘡?fù)?，?lái)源:我所監(jiān)督抽樣樣品(吉林省天光藥業(yè)有限 公 司，批 號(hào):20130201，20130204，20130307，20130312);乙腈、磷酸為色譜純;甲醇為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［2－4］色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈—0.4%磷酸溶液(14∶86);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng) 327 nm［2］。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品12.78 mg，置50 mL棕色量瓶中，用適量50%乙醇溶解，超聲，冷卻定容，搖勻，即得濃度為255.6 mg·L-1的綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。見(jiàn)圖1。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20丸，研細(xì)，取細(xì)粉約0.54 g(相當(dāng)于4丸的重量)，精密稱(chēng)定，置25 mL棕色量瓶中，加入50%乙醇適量，置超聲儀中超聲30 min，放冷至室溫，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。見(jiàn)圖2。

2.2.3 樣品陰性對(duì)照溶液 按清熱暗瘡?fù)璧奶幏?，稱(chēng)取除金銀花的粉末約0.54 g，按供試品制備方法制備陰性對(duì)照溶液。在供試品色譜圖中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有著相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性溶液在此保留時(shí)間無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明沒(méi)有其它成分干擾峰。見(jiàn)圖3。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察 分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、4、10、20、30 mL 置 50 mL 棕色量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，按上述色譜條件，精密吸取上述對(duì)照品溶液及儲(chǔ)備液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)(mg·L-1)，得綠原酸的線性回歸方程為 Y=0.532 5X-0.077 71(r=0.999 99)，在 2.556 ～ 255.6 mg·L-1的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 檢測(cè)限 按信噪比3∶1計(jì)，綠原酸的檢出限為 0.051 mg·L-1。

2.3.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取樣品陰性對(duì)照溶液10μL，注入液相色譜儀，結(jié)果表明，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下10 mL對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 5次，綠原酸的面積為27.079、27.051、27.037、27.129、27.039，RSD=0.039%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品測(cè)定項(xiàng)下的供試品溶液(批號(hào):20130201)，分別在 0、2、4、6、8、10、12、14、18、30 h進(jìn)樣測(cè)試，記錄色譜圖，其峰面積的RSD為0.60%，提示在30 h內(nèi)都可進(jìn)行相對(duì)準(zhǔn)確的定量分析。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品(批號(hào):20130201)6份，各測(cè)定2次，照樣品測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算含量，綠原酸的平均含量為2.088 3 mg·g-1，RSD 為 0.69%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的樣品(批號(hào):20130204)，置25 mL棕色量瓶中，共9份，分成3組，每組分別精密加入含綠原酸51.12 mg·L-1對(duì)照品溶液液 4、5、6 mL，照“2.2.2”制備方法得加樣回收率試驗(yàn)溶液，精密量取10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果綠原酸平均回收率為99.8%，RSD=0.82%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 綠原酸加樣回收率

2.4 樣品的測(cè)定 取本品3批(批號(hào):20130201，20130307，20130312)，各取2份，精密稱(chēng)取適量，置25 mL棕色量瓶中，照“2.2.2”制備方法得供試品溶液。精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見(jiàn)圖2)，用回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 綠原酸樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚三個(gè)不穩(wěn)定部分。由于綠原酸的特殊結(jié)構(gòu)，決定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等極性溶劑從植物中提取出來(lái)，但是由于綠原酸本身的不穩(wěn)定性，提取時(shí)不能高溫、強(qiáng)光及長(zhǎng)時(shí)間加熱。綠原酸的供試液放置于棕色瓶、冰箱(2℃)保存時(shí)最為穩(wěn)定。本文經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究及參考相關(guān)資料，確定綠原酸的提取溶劑為50%甲醇，超聲時(shí)間 30 min 最佳［5-6］。

因供試品含多組分物質(zhì)，圖譜中還有相關(guān)色譜峰，而綠原酸屬于有機(jī)酸，在HPLC測(cè)定時(shí)易發(fā)生前沿或拖尾峰，流動(dòng)相中加入酸可以改善峰形［7-9］。參考藥典，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相乙腈—0.4%磷酸的比例，綠原酸峰的保留時(shí)間約為8.0 min，所有成分全部出峰時(shí)間為35 min，柱效高，峰形好，綠原酸與其它相鄰的色譜峰達(dá)到完全分離。

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