2′4-二硝基氟苯柱前衍生HPLC檢測樹莓中游離氨基酸

趙英蓮，牟德華，李 艷,2,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

2′4-二硝基氟苯柱前衍生HPLC檢測樹莓中游離氨基酸

趙英蓮1，牟德華1，李 艷1,2,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

目的：建立一種簡單、快速、可同時檢測22 種氨基酸的色譜方法，并利用此方法對樹莓中的游離氨基酸進(jìn)行檢測和分析，為樹莓的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法：以2,4-二硝基氟苯為柱前衍生試劑，Hypersil ODS2色譜柱，流動相A為40 mmol/L pH 6.4乙酸鈉溶液，流動相B為體積分?jǐn)?shù)50%乙腈-水溶液，梯度洗脫，反相高效液相色譜，二極管陣列檢測器，檢測波長360 nm。結(jié)果：22 種氨基酸線性方程的相關(guān)系數(shù)范圍為0.993 1～1.000 0，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.95%～4.98%之間，加標(biāo)回收率為97.10%～103.39%，最低檢出限為0.39～2.87 μg/mL，定量限為1.29～9.47 μg/mL。利用所建方法檢測出樹莓中含有14 種游離氨基酸，其中6 種人體必需氨基酸，占總氨基酸含量的29.36%。結(jié)論：所建方法操作簡便、重復(fù)性好，樹莓氨基酸含量豐富，有開發(fā)價值。

樹莓；游離氨基酸；高效液相色譜法；柱前衍生；2,4-二硝基氟苯

樹莓（Rubus spp.）屬薔薇科（Rasaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物[1]。在我國樹莓的品種有210多種，全國各地均有種植[2]。樹莓是一種酸漿屬水果，富含鈣、磷、鉀和維生素等人體不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，VC含量高于其他漿果[3]。此外，樹莓中含有豐富的氨基酸。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位，也是生物合成酶的重要組成單位，

對人體健康有重要作用。袁藝[4]、王文芝[5]等利用氨基酸分析儀檢測研究了不同品種樹莓中的氨基酸。目前，對于果蔬食品中氨基酸分析的方法主要有氣相色譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、氨基酸分析儀[8]和液相色譜法[9]。樹莓中氨基酸含量的檢測是采用氨基酸分析儀[4-5]。由于氨基酸分析儀操作復(fù)雜，成本較高，在高校和企業(yè)中使用并不普遍。而反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）結(jié)合柱前衍生檢測氨基酸的方法因其運行時間短、設(shè)備簡單，且成本相對較低而備受關(guān)注。Fabiani等[10]用RP-HPLC以氯甲酸芴甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl）為衍生試劑檢測了果汁中16 種氨基酸；戴宏芬等[11]應(yīng)用RP-HPLC以2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB）為柱前衍生試劑檢測了青果中16 種氨基酸；高向陽等[12]以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯為衍生試劑檢測了齒果酸模中17 種氨基酸。徐柏球等[13]研究了荔枝中的17 種氨基酸。然而在果蔬類食品氨基酸含量檢測中，尚未見可同時檢測22 種氨基酸的報道，也未見到用RPHPLC對樹莓中的氨基酸進(jìn)行檢測的報道。因此，建立一種快速、可靠、準(zhǔn)確，并同時檢測22 種氨基酸的方法，用于檢測分析樹莓及同類型漿果的氨基酸含量，可為其開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹莓 河北贊皇丸京果品有限公司。樹莓采摘后將其分裝并貯存在－20 ℃冰箱中。

22 種氨基酸標(biāo)品：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、羥基脯氨酸（Hyp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys-Cys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、賴氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）（純度均≥98%） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 湖北杜文化工科技有限公司；DNFB 艾科化學(xué)試劑公司；磷酸二氫鉀、無水乙酸鈉、冰乙酸、三乙胺、硼砂、硼酸、氫氧化鈉均為分析純；實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀（配有2695分離單元、2996型二極管陣列檢測器） 美國Waters公司；Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

pH 9.0硼酸溶液、pH 7.0磷酸緩沖溶液的配制見參考文獻(xiàn)[14]。

流動相A：稱取3.56 g無水乙酸鈉，溶于1 000 mL水中，加入體積分?jǐn)?shù)0.1%三乙胺，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 6.4[15]。

流動相B：體積分?jǐn)?shù)50%乙腈-水溶液。

衍生試劑的配制：取0.5 mL的DNFB，用乙腈定容至50 mL。

氨基酸標(biāo)品的制備：稱取異亮氨酸25 mg、酪氨酸10 mg，其余20 種氨基酸各50 mg，分別用pH 9.0硼酸緩沖溶液溶解，定容至10 mL。取異亮氨酸1 mL，酪氨酸2.5 mL，其余20 種氨基酸各0.5 mL混合，用pH 9.0硼酸定容到25 mL，所得溶液為氨基酸混標(biāo)，置于4 ℃冰箱避光保存1 個月。

1.3.2 衍生試劑與衍生程序

采用DNFB為柱前衍生試劑。

衍生程序為：取0.5 mL氨基酸混標(biāo)溶液，加入到5 mL棕色容量瓶中，再分別加入NaHCO3緩沖溶液和DNFB各0.5 mL，放入60 ℃水浴中，暗處反應(yīng)60 min。取出，冷卻至室溫，用平衡緩沖溶液（pH 7.0磷酸緩沖溶液）定容至5.0 mL，靜置15 min，取10 μL進(jìn)樣分析[14]。

1.3.3 色譜條件

流速1 mL/min；檢測波長360 nm[14]；柱溫23 ℃；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫，程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution programogram

1.3.4 氨基酸檢測方法的建立

1.3.4.1 線性方程

取一定量的混標(biāo)溶液用pH 9.0硼酸進(jìn)行稀釋，得到5 種不同質(zhì)量濃度的氨基酸混標(biāo)液。分別取500 μL混標(biāo)溶液進(jìn)行衍生和色譜分析。測定的結(jié)果以峰面積y對氨基酸質(zhì)量濃度x作線性方程：y=ax＋b，進(jìn)行線性回歸分析。檢出限（limit of determination，LOD）為3 倍的信噪比，定量限（limit of quantifi cation，LOQ）為10 倍的信噪比。

1.3.4.2 精密度和準(zhǔn)確性

精密度：取衍生后的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，考察峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

準(zhǔn)確性：以樹莓汁樣品作為空白基質(zhì)，添加已知質(zhì)量濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行衍生后測定其加標(biāo)回收率，采用外標(biāo)法計算回收率。

1.3.5 樣品的制備

樹莓檢測時將其解凍、破碎、過濾、4 500 r/min離心15 min，分離上清液置于干凈的試管中用pH 9.0硼酸堿化，得到pH 8.2的樣品，待測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

色譜分析采用儀器自帶Waters-Empower軟件。所有線性方程、重復(fù)性和準(zhǔn)確性實驗的數(shù)據(jù)均由Excel 2007計算得出。樣品處理的數(shù)據(jù)及結(jié)果分析采用OriginLab Origin V8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生試劑選擇

因大多數(shù)氨基酸不含芳香環(huán)等紫外或可見光吸收基團，無法直接用紫外和可見光吸收法檢測，需先將氨基酸衍生轉(zhuǎn)化成具有較強紫外或者熒光吸收的衍生產(chǎn)物，使其在360 nm波長處紫外光區(qū)有吸收峰。氨基酸的衍生有柱前衍生和柱后衍生。本實驗采用RP-HPLC結(jié)合柱前衍生檢測氨基酸含量。一般用于柱前衍生的試劑有鄰苯二甲醛（o-phthaldialdelhyde，OPA）[16-20]、FMOCCl[21-22]、異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）[23]和DNFB[24]等。每種衍生試劑都有各自的優(yōu)缺點，OPA與氨基酸在室溫條件下反應(yīng)1 min即可形成具有很強熒光的衍生產(chǎn)物，而OPA本身不具有熒光性，不會對色譜分離產(chǎn)生影響。但是它僅與一級氨基酸發(fā)生反應(yīng)，與二級氨基酸（脯氨酸和羥基脯氨酸）不發(fā)生反應(yīng)。PITC和FMOC-Cl均能與一級和二級氨基酸發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定單一的衍生產(chǎn)物，但是PITC衍生過程比較復(fù)雜，需要去除多余的試劑，且痕量的PITC也會縮短分析柱的壽命；FMOC-Cl形成的衍生產(chǎn)物一般適合于熒光檢測器。DNFB作為柱前衍生試劑，它能與一級、二級氨基酸反應(yīng)形成單一穩(wěn)定的衍生產(chǎn)物[25]，且在紫外、可見光區(qū)進(jìn)行檢測。所以本實驗采用DNFB作為柱前衍生試劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱溫度對多組分的分離有重要影響，實驗考察柱溫的變化范圍為22～33 ℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫在23 ℃以上，且隨著柱溫升高苯丙氨酸和組氨酸重合，其他氨基酸分離度變化不明顯。所以本實驗采用柱溫23 ℃。苯丙氨酸和組氨酸的分離度受溫度影響較大的原因可能是由于二者的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，不易分離。溫度降低時，有可能使兩者與固定相的相互作用力發(fā)生了不同程度的改變，從而使兩者分開。

本實驗考察了流動相流速為0.5～1.0 mL/min對氨基酸分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速低于1.0 mL/min時，谷氨酰胺和絲氨酸被衍生試劑的水解產(chǎn)物2,4-硝基苯酚（2,4-dinitrophenol，DNP-OH）所覆蓋。主要是因為流速太慢，谷氨酰胺和絲氨酸在柱中停留時間變長，而柱中DNP-OH含量相對較高，所以三者容易重疊。通過調(diào)整流速為1.0 mL/min，再調(diào)整梯度洗脫程序，從而使谷氨酰胺和絲氨酸達(dá)到了基線分離。優(yōu)化后22 種氨基酸實現(xiàn)了分離和同時檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，22 種氨基酸均達(dá)到基線分離，可用于氨基酸的定性和定量分析。

圖1 優(yōu)化后的色譜圖Fig.1 Optimized chromatogram

2.3 氨基酸檢測方法的建立

2.3.1 線性關(guān)系、線性范圍、LOD和LOQ

表2 線性方程相關(guān)系數(shù)、線性范圍、線性關(guān)系、LOD、LOQQ和RRSSDDTable2 Linear equations with correlation coefficients and linear ranges detection limit quantification limit and relative standard deviation ((RRSSDD))

2.3.2 精密度與準(zhǔn)確性

以22 種氨基酸峰面積的RSD表示方法的重復(fù)性，連續(xù)5 次進(jìn)樣檢測的RSD在0.95%～4.98%之間，重復(fù)性好。向樹莓汁中添加3 個不同的已知質(zhì)量濃度的14 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生后測定加標(biāo)回收率表示方法的準(zhǔn)確性，回收率在97.10%～103.39%之間。

2.4 樣品的處理及氨基酸含量測定

2.4.1 樣品處理

氨基酸和衍生試劑反應(yīng)所需要的環(huán)境為弱堿性，而樹莓汁pH 3.2，為酸性，故在衍生前需要對樣品堿化。為不引進(jìn)新的干擾離子，選擇了硼酸和碳酸氫鈉進(jìn)行比較研究，結(jié)果見表3。將2 種試劑處理后的樣品分別進(jìn)行衍生后，過0.45 μm微孔膜過濾，取10 μL進(jìn)行上機分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用碳酸氫鈉調(diào)堿，除酪氨酸外，所測樹莓各種游離氨基酸的含量均少于用硼酸處理測得的結(jié)果，見圖2。用碳酸氫鈉堿化的樣品在衍生過程中出現(xiàn)絮狀沉淀，可能正是這些不溶物使氨基酸含量下降。

表3 樣品處理Table3 Comparison of two alkalization methods before derivatization

圖2 不同處理對氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of different alkalization methods on the contents of amino acids

2.4.2 樹莓中氨基酸含量的測定

在助力“一帶一路”的金融制度中，絲路基金的設(shè)立也頗具亮點。絲路基金由中國出資400億美元，其設(shè)立目標(biāo)主要用于支持具有戰(zhàn)略意義的中長期的基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)、資源開發(fā)、產(chǎn)業(yè)合作項目。亞投行的重心在于為相關(guān)項目提供間接融資，而絲路基金則定位于中長期開發(fā)投資基金，兩者各有側(cè)重。盡管中國在“一帶一路”國際高峰論壇上宣布向絲路基金增資1 000億人民幣，但與中長期項目需要的龐大資金體量相比，仍然是杯水車薪，這也決定了絲路基金必須發(fā)揮間接指引功能和杠桿功能，引導(dǎo)社會資金進(jìn)入。據(jù)亞洲開發(fā)銀行研究所測算，亞洲地區(qū)2010—2020年需要超過8萬億美元的基礎(chǔ)設(shè)施投資費用。

以DNFB為柱前衍生試劑，采用HPLC法檢測石家莊市贊皇地區(qū)種植的樹莓中游離氨基酸，樣品色譜圖見圖3，具體結(jié)果見表4。

由表4可知，樹莓中含有14 種游離氨基酸，其中包含6 種人體必需氨基酸。樹莓中游離氨基酸的總量為31 377.45 μg/100 g，其中丙氨酸、天冬酰胺和賴氨酸含量較高，分別為8 011.18、6 393.52 μg/100 g和3 705.33 μg/100 g。而且這3 種氨基酸含量的總和占總游離氨基酸含量的55.9%。6 種人體必需氨基酸含量占總游離氨基酸含量的29.36%，體現(xiàn)了樹莓的高營養(yǎng)價值。

圖3 樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample

表4 樹莓中氨基酸含量及其RSD、回收率及其RRSSDDTable4 The contents with RSD and recoveries with RSD of amino acids in raspberrrriieess

3 結(jié) 論

本實驗建立了一種簡單、快速、可靠，并能同時檢測22 種氨基酸的方法，該方法的R2大于0.993 1，回收率97.10%～103.39%，RSD不大于4.98%。采用此方法檢測到樹莓中14 種游離氨基酸，典型的氨基酸為天冬酰胺，丙氨酸和賴氨酸。其中丙氨酸可作為食品調(diào)味品、防腐劑；天冬酰胺具有降血壓功效；賴氨酸為人體必需氨基酸，可用于食品營養(yǎng)強化劑和除臭劑。證實了樹莓的營養(yǎng)價值，可為樹莓的開發(fā)利用和深加工提供科學(xué)依據(jù)。

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High Performance Liquid Chromatographic Analysis of Free Amino Acids in Raspberry Using Pre-Column Derivatization with 2′4-Dinitrofluorobenzene

ZHAO Yinglian1′MOU Dehua1′LI Yan1′2′*
(1. College of Biological Science and Engineering Hebei University of Science and Technology Shijiazhuang 050018′China; 2. R amp D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province Shijiazhuang 050018′China)

A simple and rapid reversed-phase high-performance liquid chromatographic (RP-HPLC) method for the simultaneous analysis of 22 free amino acids was established and applied to analyze free amino acids in raspberries. The method was based on pre-column derivatization with 2,4-dinitrofl uorobenzene (DNFB). The compounds were separated on a Hypersil ODS2column. The mobile phase used was a mixture of phase A containing 40 mmol/L sodium acetate buffer (pH 6.4) and phase B containing 50% acetonitrile-water through the gradient elution. Detection was performed using a diode array detector at 360 nm. The method showed good linearity with coeffi cients (R2) of determination varying between 0.993 1 and 1.000 0 and precision (relative standard deviation, RSD) ranging from 0.95% to 4.98%, and recovery rates were in the range between 97.10% and 103.39% for 22 amino acids. The limits of detection and quantifi cation were 0.39?2.87 μg/mL and 1.29?9.47 μg/mL, respectively. This method proved to be simple and reproducible and was applied to detect 14 free amino acids in raspberries, including 6 essential amino acids (EEAs). The contents of EEAs accounted for 29.36% of the total amino acids. The amino acid content of raspberries is abundant, indicating that this kind of berry has the potential to be developed into functional foods.

raspberry; free amino acids; high performance liquid chromatography (HPLC); pre-column derivatization; 2,4-dinitrofl uorobenzene

TS262.7

A

1002-6630（2015）06-0178-05

10.7506/spkx1002-6630-201506033

2014-07-14

河北省科技支撐計劃項目（11230604D-5-2）

趙英蓮（1989—），女，碩士研究生，研究方向為傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)。E-mail：1363149012@qq.com

*通信作者：李艷（1958—），女，教授，學(xué)士，研究方向為傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)。E-mail：lymdh5885@163.com