牛蒡根多酚和黃酮超高壓提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性

范金波，蔡茜彤，馮敘橋*，侯 宇，范林林

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013）

牛蒡根多酚和黃酮超高壓提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性

范金波，蔡茜彤，馮敘橋*，侯 宇，范林林

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013）

對(duì)牛蒡根多酚與黃酮的超高壓提取工藝和抗氧化活性進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用Box-Behnken設(shè)計(jì)，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化牛蒡根多酚和黃酮提取工藝。依據(jù)數(shù)據(jù)的模型擬合和回歸分析，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比是影響多酚和黃酮得率的重要因素，并最終獲得超高壓輔助提取牛蒡根多酚和黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶28（g/mL）、壓力236 MPa、保壓時(shí)間9 min、室溫提取，采取該工藝得到牛蒡根多酚得率為（107.83±1.148） mg/g，黃酮得率為（21.27±0.950） mg/g。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：牛蒡根多酚提取物具有較強(qiáng)的金屬離子螯合能力（IC50值為（1.393±0.011） mg/mL）、DPPH自由基清除能力（IC50值為（0.309±0.007） mg/mL）和鐵離子還原能力。

牛蒡根；超高壓；多酚；黃酮；響應(yīng)面；抗氧化

超高壓是指在較低溫度或室溫條件下將物料放入液體介質(zhì)中，利用100～1 000 MPa的壓力產(chǎn)生極高的靜電壓使基質(zhì)材料的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞生物高分子立體結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子鍵以及疏水鍵等非共價(jià)鍵，大大減小了目標(biāo)成分的擴(kuò)散阻力，同時(shí)超高壓在升、降壓的過(guò)程中，瞬間的壓差又為溶質(zhì)的擴(kuò)散提供了很高的傳質(zhì)動(dòng)力，使提取過(guò)程更易進(jìn)行[1-2]。利用超高壓技術(shù)提取天然產(chǎn)物，可以降低能耗、減少雜質(zhì)的形成、縮短提取時(shí)間、避免熱效應(yīng)引起有效成分結(jié)構(gòu)變化的同時(shí)，由于超高壓只破壞非共價(jià)鍵，使得共價(jià)鍵的活性成分不受破壞，提高天然產(chǎn)物的提取率[3-4]。

果蔬中的多酚類化合物作為天然的抗氧化劑能夠阻止活性氧和活性氮的增加，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑的穩(wěn)態(tài)，防止或減弱生物大分子的氧化損傷，從而達(dá)到降低許多慢性疾病的發(fā)病率以及延緩衰老的作用[5]。此外，多酚類化合物能夠形成食品中的苦味、澀味、香味、顏色以及氧化穩(wěn)定性等，是果蔬、谷物等食品感官質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的決定因素[6]。Mikami-Konishide等[7]研究日本的71 種果蔬多酚提取物清除氧自由基的能力，發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚提取物清除氧自由基的能力僅次于長(zhǎng)果種、紫蘇和空心菜，位于第4位。婁在祥[8]利用超聲微波輔助提取牛蒡葉多酚，并鑒定了牛蒡葉的11 種活性成分，包括綠原酸、咖啡酸、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、苯甲酸等，且研究發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚提取物有著與合成抗氧化劑特丁基對(duì)苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）相近的抗氧化活性。Ku[9]、Liu[10]等報(bào)道牛蒡多酚提取物對(duì)于幽門螺桿菌引發(fā)的胃潰瘍有輔助治療作用。

本實(shí)驗(yàn)以牛蒡根為研究對(duì)象，通過(guò)超高壓輔助提取牛蒡根多酚和黃酮，優(yōu)化了牛蒡根多酚和黃酮的提取條件，并通過(guò)2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、金屬離子螯合能力和鐵離子還原能力等多種體外體系對(duì)牛蒡根多酚和黃酮提取物的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而進(jìn)一步了解了牛蒡根的生物活性，為超高壓技術(shù)在牛蒡天然產(chǎn)物領(lǐng)域的提取和應(yīng)用及牛蒡根進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡根 徐州大自然公司。

DPPH 百靈威科技有限公司；菲洛嗪 合肥博美生物有限公司；Folin-Ciocalteu試劑 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；2,4,6-三吡啶基三嗪 阿拉丁試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RRH-A500高速多功能粉碎機(jī) 上海緣沃工貿(mào)有限公司；UV-2700紫外-可見光分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；JA5003電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge5804-R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；HPP.L2-600/0.6超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼超高壓設(shè)備有限公司；SF-300塑料薄膜封口機(jī) 溫州市興業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡根預(yù)處理

將新鮮牛蒡根清洗切片并于0.5%抗壞血酸溶液中浸泡30 min[11]，瀝干切碎后，40 ℃烘干恒質(zhì)量，粉碎過(guò)篩，制得牛蒡根干粉。準(zhǔn)確稱取一定量粉碎過(guò)篩的牛蒡根粉于蒸煮袋中，加入乙醇溶液，混勻封口，放入超高壓設(shè)備中，于不同條件下提取牛蒡根多酚和黃酮。將浸提后的萃取液于4 000 r/min離心10 min，收集上清液，定容，得到牛蒡根多酚和黃酮提取液。

1.3.2 多酚含量的測(cè)定

1.3.2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定[12]。準(zhǔn)確稱取沒食子酸對(duì)照品10 mg，用80%乙醇溶液溶解并定容50 mL。準(zhǔn)確移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL沒食子酸對(duì)照品溶液于25 mL比色管中，依次加入福林-酚試劑0.2 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的Na2CO3溶液2.0 mL，用80%乙醇溶液定容，使其最終質(zhì)量濃度分別為0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 μg/mL，室溫條件下靜置60 min，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度（x）與多酚質(zhì)量濃度（y）的方程：y=0.004 35x＋0.000 9（R2=0.998 9）。

1.3.2.2 牛蒡根提取液多酚含量的測(cè)定

取1.0 mL牛蒡根提取液加入25 mL比色管中，依次加入福林-酚試劑0.2 mL、15% Na2CO3溶液2.0 mL、80%乙醇溶液定容，室溫條件下靜置60 min，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得比色管中牛蒡根多酚質(zhì)量濃度，并按式（1）計(jì)算牛蒡根多酚得率。

式中：ρ為比色管中牛蒡根多酚質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為比色管量程，25 mL；V2為反應(yīng)體系中牛蒡根提取液體積，1.0 mL；V為多酚提取液總體積/mL；m為牛蒡根粉總質(zhì)量/g。

1.3.3 黃酮含量的測(cè)定

1.3.3.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定[13]。準(zhǔn)確稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，用80%乙醇溶液定容50mL。準(zhǔn)確移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液于25 mL比色管中，加入5% NaNO2溶液0.4 mL搖勻，靜置6 min，再加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL搖勻，靜置6 min，最后加入4% NaOH溶液4.0 mL，用80%乙醇溶液定容，室溫靜置15 min，測(cè)定509 nm波長(zhǎng)處吸光度，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到吸光度（x）與黃酮質(zhì)量濃度（y）的方程：y=0.013 1x—0.000 1（R2=0.998 7）。

1.3.3.2 牛蒡根黃酮含量的測(cè)定

取1.0 mL牛蒡根提取液加入25 mL比色管中，加入5% NaNO2溶液0.4 mL搖勻，靜置6 min，再加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL搖勻，靜置6 min，最后加入4% NaOH溶液4.0 mL，加入80%乙醇溶液定容，室溫靜置15 min，測(cè)定509 nm波長(zhǎng)處吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式（2）求得比色管中牛蒡根黃酮得率。

式中：ρ為比色管中牛蒡根黃酮質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為比色管量程，25 mL；V2為反應(yīng)體系中牛蒡根提取液體積，1.0 mL；V為黃酮提取液總體積/mL；m為牛蒡根粉總質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 料液比對(duì)牛蒡根多酚和黃酮得率的影響

分別選取料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、保壓時(shí)間9 min、壓力400 MPa條件下，研究料液比對(duì)牛蒡根多酚得率的影響。

1.3.4.2 超高壓壓力對(duì)牛蒡根多酚和黃酮得率的影響

分別選取超高壓壓力100、200、300、400、500 MPa，在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、保壓時(shí)間9 min、料液比1∶25（g/mL）條件下，研究壓力對(duì)牛蒡根多酚得率的影響。

1.3.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)牛蒡根多酚和黃酮得率的影響

分別選用0%、20%、40%、60%、80%、100%體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為溶劑，在保壓時(shí)間9 min、料液比1∶25（g/mL）、壓力400 MPa條件下，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)牛蒡根多酚得率的影響。

1.3.4.4 保壓時(shí)間對(duì)牛蒡根多酚和黃酮得率的影響

分別選用保壓時(shí)間3、5、7、9、11、13 min，在料液比1∶25（g/mL）、壓力400 MPa、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%條件下，研究保壓時(shí)間對(duì)牛蒡根多酚得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合實(shí)際操作條件，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和壓力為3 個(gè)考察因素，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，選3 個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行15 個(gè)試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立二次響應(yīng)回歸模型，擬合得到二次回歸方程。

1.3.6 牛蒡根提取物抗氧化活性的研究

1.3.6.1 金屬離子螯合能力

參照Gulcin等[14]的測(cè)定方法，以多酚的質(zhì)量濃度為參考標(biāo)準(zhǔn)，向2.4 mL系列質(zhì)量濃度的牛蒡根提取物溶液中依次加入現(xiàn)配的30 μL 2 mmol/L的FeCl2溶液和60 μL 5 mmol/L的菲咯嗪溶液，混合均勻后室溫靜置10 min，測(cè)定混合液在562 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以等量的超純水代替樣品溶液作為空白對(duì)照。以樣品質(zhì)量濃度為自變量，自由基清除率為因變量作圖并進(jìn)行線性擬合，計(jì)算IC50值，其中IC50值定義為清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的質(zhì)量濃度，所需質(zhì)量濃度越低，表明該物質(zhì)金屬離子螯合能力越強(qiáng)[15]。見式（3）：

式中：AS為樣品管的吸光度；A0為對(duì)照管的吸光度。1.3.6.2 DPPH自由基清除活性

稱取0.009 85 g DPPH以無(wú)水乙醇定容至250 mL作為DPPH工作液，在反應(yīng)體系中，以多酚的質(zhì)量濃度為參考標(biāo)準(zhǔn)，于10 mL試管中加入0.2mL系列質(zhì)量濃度的牛蒡根提取物溶液，再加入2.0 mL DPPH工作液，振蕩搖勻，于室溫條件下避光靜置30 min，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以加入等量的乙醇作為空白對(duì)照[16]。以樣品質(zhì)量濃度為自變量，自由基清除率為因變量作圖并進(jìn)行線性擬合，按式（4）計(jì)算IC50值。

式中：AS為樣品管的吸光度；A0為對(duì)照管的吸光度。1.3.6.3 鐵離子還原能力

稱取1.550 00 g三水合乙酸鈉加入8.0 mL冰醋酸，以超純水定容至500 mL；稱取0.156 20 g 2,4,6-三吡啶基三嗪，加入165 μL濃鹽酸，以超純水定容至50 mL；稱取0.162 10 g FeCl3，加入30.0 mL超純水溶解搖勻。以上3 種溶液按體積10∶1∶1比例混合配制成鐵離子還原法工作液，以多酚的質(zhì)量濃度為參考標(biāo)準(zhǔn)，于10 mL試管中分別加入0.2 mL不同質(zhì)量濃度的牛蒡根提取物溶液，再加入2.0 mL FRAP工作液，振蕩搖勻，于37 ℃條件下靜置10 min，測(cè)定593 nm波長(zhǎng)處吸光度[17]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)均用Origin 8.5軟件處理作圖，Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析，SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用±s表示，P＜0.05表示有顯著差異，P＜0.01表示具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)牛蒡根多酚和黃酮得率的影響

如圖1所示，在料液比1∶15～1∶40范圍內(nèi)，隨著提取液用量的增大，多酚和黃酮得率均呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，黃銅與多酚得率同時(shí)達(dá)到最大值，由此確定牛蒡根多酚最適提取料液比為1∶30。

圖1 料液比對(duì)牛蒡根多酚（a）和黃酮（b）得率的影響Fig.1 Effects of solid to liquid ratio on the yield of polyphenols and flavones from burdock roots

2.1.2 壓力對(duì)牛蒡根多酚和黃酮得率的影響

圖2 壓力對(duì)牛蒡根多酚（a）和黃酮（b）得率的影響Fig.2 Effects of ultrahigh pressure on the yield of polyphenols and flavones from burdock roots

如圖2所示，在100～500 MPa壓力范圍內(nèi)，隨著壓力的升高，牛蒡根多酚及黃酮得率均呈現(xiàn)“增加-下降-增加-下降”的變化趨勢(shì)，兩個(gè)極值點(diǎn)分別在200、400 MPa處得到，比較兩處多酚得率的大小，發(fā)現(xiàn)400 MPa處多酚和黃酮得率均高于200 MPa處，由此確定牛蒡根多酚最適提取壓力為400 MPa。研究中牛蒡根多酚隨壓力變化的趨勢(shì)與岳亞楠等[18]研究結(jié)果相一致。處理壓力的大小決定了提取物細(xì)胞與外界環(huán)境之間的壓力差，壓力差越大，溶劑越容易滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞內(nèi)容物接觸，有利于有效成分的提取，但壓力過(guò)大可能會(huì)破壞某些有效成分，因此多酚得率會(huì)呈現(xiàn)先增加后降低再增加的趨勢(shì)[2]。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)牛蒡根多酚和黃酮得率的影響

由圖3所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚及黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，二者均達(dá)到最大值，由此確定牛蒡根多酚超高壓提取最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)牛蒡根多酚（a）和黃酮（b）得率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on yield of polyphenols and flavones from burdock roots

2.1.4 保壓時(shí)間對(duì)牛蒡根多酚和黃酮得率的影響

圖4 保壓時(shí)間對(duì)牛蒡根多酚（a）和黃酮（b）得率的影響Fig.4 Effects of dwell time on the yield of polyphenols and flavones from burdock roots

如圖4a所示，多酚得率隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)趨勢(shì)，在9 min處達(dá)到最大值，如圖4b所示，黃酮得率隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，且通過(guò)軟件分析得在7 min和9 min處黃酮得率無(wú)顯著差異（P＞0.05），由此可確定黃酮的最適保壓時(shí)間是7 min，綜合上述兩種情況確定牛蒡根多酚最適提取時(shí)間為9 min。由于多酚和黃酮得率受保壓時(shí)間影響較?。ㄗ畲笈c最小值差別分別為2.24 mg/g和1.59 mg/g），所以在下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中不再考慮該因素。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡根多酚提取工藝結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合試驗(yàn)設(shè)備條件選取乙醇體積分?jǐn)?shù)X1、料液比X2、提取壓力X3為牛蒡根多酚提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的3 個(gè)因素，固定保壓時(shí)間為9 min。響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table1 Design-Expert design scheme and experimental results

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，獲得超高壓輔助提取牛蒡根多酚得率（Y1）和黃酮得率（Y2）對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）、壓力（X3）的二次回歸模型方程分別為：

表2 多酚結(jié)果方差分析Table2 Analysis of variance (ANOVA of polyphenols

表3 黃酮結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance (ANOVA of flavonesvones

對(duì)此模型進(jìn)行回歸分析，多酚和黃酮的分析結(jié)果如表2、3所示，由表2可知，多酚得率試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型整體呈極顯著水平（P＜0.01），失擬不顯著（P＞0.05）。乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及二者的二次項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響呈極顯著水平（P＜0.01），壓力的二次項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響呈極顯著水平（P＜0.01）。乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和壓力三者之間的交互作用不顯著，各因素對(duì)牛蒡根多酚得率影響大小順序依次為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞壓力。回歸方差分析結(jié)果表明，該模型相關(guān)系數(shù)R2為0.992 3，模型校正相關(guān)系數(shù)R2Adj為0.978 6，說(shuō)明此模型可以解釋97.86%響應(yīng)值的變化。變異系數(shù)為0.82%，較小，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。由于壓力（X3）對(duì)多酚得率無(wú)顯著影響，固定壓力為400 MPa，可得到乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的變化對(duì)牛蒡根多酚得率影響的響應(yīng)面分析圖（圖5）。

由表3可知，黃酮得率試驗(yàn)設(shè)計(jì)整體模型呈極顯著水平，失擬不顯著。乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比及二者的二次項(xiàng)對(duì)黃酮得率的影響呈極顯著水平，壓力和壓力的二次項(xiàng)對(duì)黃酮得率的影響不顯著。乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和壓力之間的交互作用不顯著，各因素對(duì)牛蒡根黃酮得率影響大小順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞壓力。回歸方程方差分析結(jié)果表明，該模型相關(guān)系數(shù)R2為0.995 8，模型校正相關(guān)系數(shù)為0.988 1，變異系數(shù)為0.88%，較小，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好，且能解釋98.81%響應(yīng)值的變化。固定壓力為400 MPa，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)牛蒡根黃酮得率的響應(yīng)面分析圖如圖6所示。

等高線圖同一曲線上響應(yīng)值相同，圖形中心響應(yīng)值最大，等高線圖沿某一因素軸方向曲線密度越大，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)該因素的變化越敏感，反映在響應(yīng)面上則是曲面坡度越陡峭，等高線形狀趨向橢圓且橢圓軸線與坐標(biāo)軸的角度越大，則交互作用越明顯[19]。如圖5所示的響應(yīng)面為開口向下的凸形曲面，有極高值，料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)方向的曲面坡度陡峭，且料液比方向的曲面坡度更為陡峭，說(shuō)明多酚得率對(duì)這2 個(gè)因素的變化敏感，且對(duì)料液比的變化更為敏感，與表2中參數(shù)估計(jì)相吻合。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）對(duì)多酚得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and solid-to-liquid ratio on the extraction rate of polyphenols

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）對(duì)黃酮得率的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration and solid-to-liquid ratio on the extraction rate of flavones

如圖6所示的響應(yīng)面為開口向下的凸形曲面，有極高值，在一定范圍內(nèi)，黃酮得率在乙醇體積分?jǐn)?shù)方向的曲線較料液比方向的更為陡峭，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率影響更顯著，與表3方差分析表一致。由以上兩圖可知，多酚和黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比中提取液用量的增加，呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)。這可能是因?yàn)椋涸谳^低乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，隨著體積分?jǐn)?shù)增大，多酚與多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)之間的氫鍵和疏水作用力越容易斷裂，多酚得率提高[20]，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，由相似相容原理，不易于水溶性多酚的提??；隨著提取液用量的增加，溶劑與原料的體積分?jǐn)?shù)差就越大，從而促進(jìn)傳質(zhì)過(guò)程，但差別過(guò)大時(shí)，超高壓產(chǎn)生的效應(yīng)不再明顯，導(dǎo)致多酚得率不再增加甚至降低[21]。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由軟件分析得，最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)74.02%、料液比1∶28.38、壓力236.36 MPa，在此最優(yōu)條件下多酚得率為107.17 mg/g，黃酮得率為20.33 mg/g。結(jié)合實(shí)際操作，確定提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶28、壓力236 MPa、保壓時(shí)間9 min、提取溫度為室溫，采取該工藝得到牛蒡根多酚得率為（107.83±1.148） mg/g；黃酮得率為（21.27±0.950） mg/g。模型值與實(shí)驗(yàn)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.61%和4.42%，說(shuō)明Design-Expert軟件響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)有效地對(duì)超高壓輔助提取牛蒡根多酚的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

2.4 牛蒡根提取物的抗氧化活性

2.4.1 金屬離子螯合能力

人體內(nèi)過(guò)量的金屬離子可引起脂質(zhì)過(guò)氧化，并進(jìn)一步誘導(dǎo)自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，因此，螯合金屬離子可通過(guò)間接的途徑達(dá)到抗氧化和抗自由基的目的[22]。以多酚質(zhì)量濃度為參考標(biāo)準(zhǔn)，將牛蒡根提取物稀釋成系列質(zhì)量濃度，不同質(zhì)量濃度牛蒡根提取物的金屬離子螯合能力如圖7所示。在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，金屬離子螯合能力與牛蒡根提取物多酚質(zhì)量濃度有很好的線性關(guān)系，R2=0.997 2，由此擬合曲線可得牛蒡根提取物金屬離子螯合能力的IC50值為（1.393±0.011） mg/mL，說(shuō)明牛蒡根提取物具有較強(qiáng)的金屬離子螯合能力。

圖7 不同質(zhì)量濃度的牛蒡根提取物對(duì)金屬離子螯合能力的線性擬合結(jié)果Fig.7 Dose-dependent ferric ions chelating ability of burdock root extract

圖8 不同質(zhì)量濃度牛蒡根提取物的DPPH自由基清除能力（a）及其a線性擬合結(jié)果（b）bFig.8 Dose-dependent inhibition of burdock root extract on DPPH free radical and its linear correlation

2.4.2 DPPH自由基清除能力由圖8a可知，DPPH自由基清除率隨著牛蒡根多酚提取液質(zhì)量濃度的增加呈先增加后趨于水平的趨勢(shì)，選取線性關(guān)系較好的質(zhì)量濃度范圍，以牛蒡根提取物的質(zhì)量濃度為自變量，自由基清除率為因變量的線性擬合圖如圖8b所示，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好（R2=0.999 7），由此擬合曲線可得牛蒡根提取物DPPH

自由基清除能力的IC50值為（0.309±0.007） mg/mL，說(shuō)明牛蒡根提取物具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

2.4.3 鐵離子還原能力

圖9 不同質(zhì)量濃度牛蒡根提取物的鐵離子還原能力Fig.9 Dose-dependent ferric reducing ability of burdock root extract

在0.2 mL一系列質(zhì)量濃度梯度的牛蒡根提取物溶液中加入2.0 mL FRAP工作液，測(cè)定各自的吸光度，并對(duì)牛蒡根提取物的抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖9所示，隨著牛蒡根提取物質(zhì)量濃度的增加，吸光度逐漸增大，即鐵離子還原能力逐漸增強(qiáng)，由此可見，鐵離子還原能力與 牛蒡根提取物質(zhì)量濃度有明顯的劑量依賴關(guān)系，牛蒡根提取物有較強(qiáng)的鐵離子還原能力。還原反應(yīng)的結(jié)果通常是終止某些對(duì)人體有害的自由基反應(yīng)[23]，由此可以推斷牛蒡根可能具有有益于人體的生物活性。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.0.6軟件和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超高壓輔助牛蒡根多酚和黃酮提取的工藝，結(jié)合實(shí)際操作確定最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶28、壓力236 MPa、保壓時(shí)間9 min、提取溫度為室溫，采取該工藝得到牛蒡根多酚得率為（107.83±1.148） mg/g，遠(yuǎn)高于前期超聲波輔助牛蒡根多酚和黃酮提取實(shí)驗(yàn)中的多酚得率（47.12 mg/g）；黃酮得率為（21.27±0.950） mg/g，與微波提取結(jié)果相近，由此可見超高壓是一種高效的多酚和黃酮類化合物輔助提取方法。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明：牛蒡根提取物具有較強(qiáng)的金屬離子螯合能力，IC50值為（1.393±0.011） mg/mL；較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，IC50值為（0.309±0.007） mg/mL；此外，牛蒡根提取物還具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力。作為一種天然抗氧化劑，牛蒡根具有較好的開發(fā)潛力。

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Optimization of Process for Ultra High Pressure-Assisted Synchronous Extraction of Polyphenols and Flavones from Burdock Roots and Their Antioxidant Activity

FAN Jinbo CAI Xitong FENG Xuqiao*′HOU Yu FAN Linlin
(Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province Food Science Research Institute Bohai University Jinzhou 121013′China)

The ultra high pres sure (UHP)-assisted simultan eous extraction and antioxidant activity of total phenols and flavones from burdock roots were studied. To optimize the extraction process, the response surface methodology with three factors at three levels was adopted on the basis of single factor experiments. Model fi tting and regression analysis of experimental data showed that two significant factors which influence total phenol and flavone yields were ethanol concentratio n and solid-to-solvent ratio. The optimal extraction conditions were determined as follows: 75% ethanol as extraction solvent, solid-to-solvent ratio 1:28 (g/mL), extraction pressure 236 MPa, pressure holding time 9 minutes, and room temperature. Under these optimal conditions, the yield of total phenols and fl avones from burdock reached (107.83 ± 1.148) and (21.27 ± 0.950) mg/g respectively. The polyphenols extracted from burdock showed strong ferric ions chelating ability (IC50(1.393 ± 0.011) mg/mL), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging activity (IC50(0.309 ± 0.007) mg/mL) and ferric ions reducing power.

burdock roots ultra high pressure total phenol fl avone response surface methodology antioxidant activity

TS201.2

A

1002-6630（2015）06-0069-07

10.7506/spkx1002-6630-201506013

2014-07-01

遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（LNSAKF2013017）

范金波（1977—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。E-mail：jinbo_fan@hotmail.com

*通信作者：馮敘橋（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：feng_xq@hotmail.com