雞胸軟骨中Ⅱ型膠原的制備工藝優(yōu)化

程 媛，曹 慧*，徐 斐，于勁松，袁 敏

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

雞胸軟骨中Ⅱ型膠原的制備工藝優(yōu)化

程 媛，曹 慧*，徐 斐，于勁松，袁 敏

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

對(duì)雞胸軟骨Ⅱ型膠原的制 備工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用鹽酸胍和NaCl 2種抽提方法去除雜蛋白，然后用胃蛋白酶酶解并考察酶解溫度、酶解時(shí)間和酶添加量對(duì)膠原提取率的影響。結(jié)果表明：4 mol/L的鹽酸胍能有效去除雜蛋白；當(dāng)酶解溫度18℃、胃蛋白酶添加量1.59%、酶解43 h時(shí)提取率最高，且此條件下的膠原提取率為56.54%，且保持著完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)酶解后制備的Ⅱ型膠原電泳圖譜出現(xiàn)α、β 2條帶，無(wú)其他雜帶，Ⅱ型膠原純度較高。

雞胸軟骨；Ⅱ型膠原；提取

Ⅱ型膠原是生物體內(nèi)透明軟骨的主要結(jié)構(gòu)組分[1]，具有維持關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗張力強(qiáng)度的功能[2]。近年來(lái)的研究表明，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的發(fā)病與Ⅱ型膠原自身免疫反應(yīng)有關(guān)[3-5]，口服Ⅱ型膠原誘導(dǎo)免疫耐受對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有顯著的防治作用[6]。

目前，常用的膠原提取方法有酸提取法、堿提取法和酶提取法。酸提取法耗時(shí)長(zhǎng)，且膠原的溶解量小[7-9]。堿提取法會(huì)破壞膠原纖維中含有羥基和巰基的氨基酸，也會(huì)破壞膠原分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)作用，同時(shí)使產(chǎn)物發(fā)生消旋現(xiàn)象[10-13]。酶法提取是利用蛋白酶將膠原蛋白的端肽和非螺旋區(qū)域切除，使切除后的膠原溶解進(jìn)而將其提取，提取率較高[14-17]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于雞胸軟骨Ⅱ型膠原提取的研究普遍存在處理量小、過(guò)程復(fù)雜等問(wèn)題，而且沒(méi)有對(duì)胃蛋白酶處理過(guò)程中Ⅱ型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)的保持進(jìn)行研究。在制備膠原的過(guò)程中，雜蛋白的去除、酶解過(guò)程的控制以及提取產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的保持始終是研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)之一，現(xiàn)在還缺乏系統(tǒng)完整的研究，這在一定程度上阻礙了Ⅱ型膠原在工業(yè)上的應(yīng)用。為解決這些問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)以雞胸軟骨為原料，利用酸性條件下酶解的方法來(lái)提?、蛐湍z原，著重研究了雞胸軟骨中雜蛋白的去除、影響雞胸軟骨Ⅱ型膠原的提取因素及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，確定了最佳的提取工藝，以期為雞胸軟骨Ⅱ型膠原在生物領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮軟骨 上海申宏冷藏儲(chǔ)運(yùn)有限公司；胃蛋白酶（1∶10 000 U/mg） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TLID-2005袖珍型低溫恒溫槽 寧波天恒儀器廠；LD85B3型真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Millrock科技公司；UV-6000 PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectoscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國(guó)Thermo電子公司。

1.3 方法

1.3.1 雞胸軟骨Ⅱ型膠原的提取流程

雞胸軟骨→清洗→剔除肌肉、骨膜、腱等非軟骨物質(zhì)→冷凍→粉碎脫脂→除雜蛋白→胃蛋白酶酶解→鹽析→透析脫鹽→冷凍干燥→Ⅱ型膠原制品

1.3.2 雜蛋白的去除

以Ⅱ型膠原提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較鹽酸胍溶解和NaCl抽提2 種方法對(duì)軟骨中雜蛋白的去除效果[18]。剔除軟骨中殘肉及其他非軟骨成分，用甲醇-氯仿（2∶1，V/V）脫脂，再將脫脂后的樣品混懸于1 mol/L NaCl或一定濃度鹽酸胍溶液中，攪拌12 h，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，棄上清液，保留沉淀。

1.3.3 胃蛋白酶酶解工藝

取等量去除雜蛋白后的沉淀混懸于0.5 mol/L HAc溶液中，加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的胃蛋白酶，4 ℃條件下酶解，酶解后10 000 r/min、4 ℃離心20 min。取上清液，用0.9 mol/L NaCl溶液鹽析，所得沉淀用0.5mol/L HAc溶液透析，冷凍干燥?？疾烀附鉁囟取⒚附鈺r(shí)間和酶添加量對(duì)膠原提取率的影響。提取率計(jì)算見(jiàn)下式[19]。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

采用SDS-PAGE電泳鑒定膠原蛋白的純度[19]。其中分離膠質(zhì)量濃度為8 g/100 mL，濃縮膠為5 g/100 mL。將制備的膠原蛋白溶液置于沸水浴中煮沸3 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液15 μL上樣。120 V電壓電泳完畢后，用0.1 g/100 mL考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色6 h，醋酸溶液脫色至背景無(wú)色后拍照。

1.3.5 FTIR

取適量冷凍干燥后的Ⅱ型膠原和溴化鉀，置于瑪瑙研缽中，研磨成粉后裝樣壓片。采用FTIR儀對(duì)樣品在400～4 000 cm—1區(qū)間進(jìn)行掃描[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胸軟骨中雜蛋白的去除

2.1.1 不同雜蛋白去除方法對(duì)提取率的影響

雞胸軟骨中的主要雜蛋白是蛋白多糖，因而本研究首先以Ⅱ型膠原的提取率為指標(biāo)，比較了NaCl抽提和鹽酸胍溶解2 種雜蛋白去除方法對(duì)提取率的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 2種雜蛋白去除方法對(duì)Ⅱ型膠原提取率的影響Fig.1 Effects of two proteoglycan-removing methods on extracting ratio of type Ⅱ collagen

如圖1所示，鹽酸胍溶解處理后Ⅱ型膠原的提取率為56.95%，顯著高于NaCl抽提的提取率28.62%。這可能是由于鹽酸胍分子為極性分子，極易形成氫鍵，可以破壞雜蛋白分子內(nèi)外原有的氫鍵，從而達(dá)到去除雜蛋白的目的。因而，選取鹽酸胍溶解法去除軟骨中的雜蛋白。

2.1.2 鹽酸胍濃度對(duì)雜蛋白去除效果的影響

圖2 鹽酸胍濃度對(duì)Ⅱ型膠原提取率的影響Fig.2 Effect of guanidine hydrochloride concentrations on extraction efficiency of type Ⅱ collagen

進(jìn)一步考察鹽酸胍濃度對(duì)雞胸軟骨中雜蛋白的去除效果。由圖2可見(jiàn)，隨著鹽酸胍濃度的增加，Ⅱ型膠原提取率不斷提高，當(dāng)鹽酸胍濃度超過(guò)4 mol/L時(shí)，雜蛋白的去除效果沒(méi)有顯著增加。因此選擇濃度為4 mol/L的鹽酸胍來(lái)去除雞胸軟骨中的雜蛋白。

2.2 酶法提取Ⅱ型膠原的最佳工藝條件

2.2.1 溫度對(duì)Ⅱ型膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)及提取率的影響

為了保持Ⅱ型膠原在提取過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的完整，首先探討溫度對(duì)Ⅱ型膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖3～5所示。

由圖3可見(jiàn)，隨著溫度的升高，酰胺A帶吸收峰減弱，表明維持Ⅱ型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵逐漸減弱，二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞。酰胺Ⅱ、Ⅰ帶隨溫度的升高雖然存在，但吸收峰減弱，表明三股螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞。由圖4、5得出，溫度由5 ℃升高至150 ℃，酰胺Ⅰ帶的吸收峰發(fā)生藍(lán)移（向高波數(shù)移動(dòng)），酰胺Ⅱ帶的吸收峰則發(fā)生紅移（向低波數(shù)移動(dòng)），表明在升溫的過(guò)程中，低波數(shù)對(duì)應(yīng)的螺旋結(jié)構(gòu)減少，高波數(shù)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，使酰胺Ⅰ帶發(fā)生藍(lán)移；而低波數(shù)對(duì)應(yīng)的伸展肽鏈結(jié)構(gòu)增加，低波數(shù)對(duì)應(yīng)的無(wú)序結(jié)構(gòu)增加，使酰胺Ⅱ帶發(fā)生紅移。以上結(jié)果說(shuō)明在升溫過(guò)程中，Ⅱ型膠原3 條α鏈之間參與形成的氫鍵不斷減弱，螺旋結(jié)構(gòu)逐漸減少，使得肽鏈伸直，螺旋度減低，Ⅱ型膠原的無(wú)序結(jié)構(gòu)增加。由此可見(jiàn)，溫度對(duì)Ⅱ型膠原的二級(jí)結(jié)構(gòu)有顯著影響。根據(jù)以上結(jié)果確定Ⅱ型膠原的提取溫度范圍為0～50℃。在0～50 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，Ⅱ型膠原的提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)。圖6顯示：5～35℃Ⅱ型膠原提取率的變化，在5～20 ℃時(shí)，Ⅱ型膠原提取率隨溫度升高而增大；當(dāng)溫度繼續(xù)升高至35 ℃時(shí)，提取率明顯降低。當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，基本無(wú)Ⅱ型膠原提出，可能是由于50 ℃已經(jīng)到達(dá)Ⅱ型膠原的變性溫度，使提取的Ⅱ型膠原發(fā)生變性。

圖3 不同溫度條件下（5～150 ℃）Ⅱ型膠原的FTIR譜圖TIRFig.3 FTIR spectra of type Ⅱ collagen with variable temperatures

圖4 不同溫度條件下（5～150 ℃）酰胺Ⅰ帶的波數(shù)變化Fig.4 Wavelength variations of amide Ⅰ band with variable temperatures

圖5 不同溫度條件下（5～150 ℃）酰胺Ⅱ帶的波數(shù)變化Fig.5 Wavelength variations of amide Ⅱ band with variable temperatures

圖6 溫度對(duì)Ⅱ型膠原提取率的影響Fig.6 Effects of temperatures on extracting efficiency of type Ⅱ collagen

2.2.2 胃蛋白酶添加量對(duì)Ⅱ型膠原的提取率及二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖7 胃蛋白酶添加量對(duì)Ⅱ型膠原提取率的影響Fig.7 Effects of pepsin concentrations on extracting efficiency of type Ⅱ collagen

胃蛋白酶添加量與Ⅱ型膠原的提取率有著密切關(guān)系。由圖7可知，在0.5%～1.5%的酶添加量范圍內(nèi)，Ⅱ型膠原的提取率隨著胃蛋白酶用量的增大而提高。這是由于在較低的酶用量范圍，底物量相對(duì)較大，足以飽和胃蛋白酶，酶解反應(yīng)的速度與胃蛋白酶用量呈正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)酶添加量超過(guò)1.5%時(shí)，Ⅱ型膠原的提取率下降，提取量降低。

圖8 不同胃蛋白酶添加量下Ⅱ型膠原的FTIR圖譜TIRFig.8 FTIR spectra of type Ⅱ collagen with various concentrations of pepsin

由圖8可見(jiàn)，當(dāng)胃蛋白酶添加量在0.5%～1.5%范圍內(nèi)，Ⅱ型膠原在3 400～3 450、2 923、1 625～1 690、1 500～1 600 cm—1和1 200～1 300 cm—1處的吸收峰未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。當(dāng)胃蛋白酶添加量達(dá)到2%時(shí)，酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅱ、Ⅰ帶的吸收峰明顯減弱，表明三股肽鏈之間的氫鍵減弱，這是由于在高添加量的胃蛋白酶作用下， Ⅱ型膠原發(fā)生了一定程度的水解，分子內(nèi)和分子間的氫鍵減弱，二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞。此外，酰胺Ⅰ帶還發(fā)生明顯藍(lán)移，表明在提取過(guò)程中，膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)減少，轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加。而酰胺Ⅱ帶發(fā)生了明顯的紅移，表明膠原蛋白的伸展肽鏈結(jié)構(gòu)增加，無(wú)序結(jié)構(gòu)增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到一定程度破壞。因此選取胃蛋白酶添加量為1.25%～1.75%。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)Ⅱ型膠原提取率及二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖9 酶解時(shí)間對(duì)Ⅱ型膠原提取率的影響Fig.9 Effects of digestion times on extracting efficiency of type Ⅱ collagen

酶解時(shí)間是影響Ⅱ型膠原提取率及二級(jí)結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要因素，由圖9可見(jiàn)，水解時(shí)間較短時(shí)，Ⅱ型膠原的提取率較低增長(zhǎng)速度較快。當(dāng)水解時(shí)間超過(guò)36 h后，Ⅱ型膠原的提取率基本不再發(fā)生變化，達(dá)到穩(wěn)定值。這是因?yàn)樘崛r(shí)間較短，胃蛋白酶沒(méi)有與底物充分作用，同時(shí)酶解后的Ⅱ型膠原還沒(méi)有及時(shí)完全地溶解到醋酸溶液中。

圖10 不同酶解時(shí)間Ⅱ型膠原的FTIR圖譜TIRFig.10 FTIR spectra of type Ⅱ collagen with various times

由圖10可知，長(zhǎng)時(shí)間的酶解對(duì)Ⅱ型膠原的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酰胺A帶發(fā)生藍(lán)移，表明由含有N—H基團(tuán)的肽段參與形成的氫鍵發(fā)生斷裂；當(dāng)酶解時(shí)間為72 h時(shí)，酰胺Ⅰ帶藍(lán)移，表明膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)減少，轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，同時(shí)Ⅱ型膠原的FTIR曲線在1028 cm—1處的峰消失，而在943、859 cm—1和537 cm—1處出現(xiàn)了雜峰，表明整個(gè)Ⅱ型膠原的螺旋度減少，無(wú)序結(jié)構(gòu)增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞。因此選擇酶解時(shí)間為24～48 h。

2.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

選取酶解溫度、胃蛋白酶添加量及酶解時(shí)間作為主要因素，以Ⅱ型膠原的提取率（R）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化Ⅱ型膠原酶解條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

利用Design-Expert軟件對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到以Ⅱ型膠原提取率為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：R=55.19—5.12A＋0.53B＋2.87C＋0.31AB＋0.043AC＋1.7BC—11.19A2—1.93B2—3.12C2。根據(jù)回歸模型利用Design Expert軟件進(jìn)行分析，得出提?、蛐湍z原的最佳工藝條件為酶解溫度17.77 ℃、胃蛋白酶添加量1.59%、酶解時(shí)間42.67 h，Ⅱ型膠原提取率理論預(yù)測(cè)值可達(dá)56.65%?？紤]到實(shí)際操作條件，最佳工藝條件確定為酶解溫度18 ℃、胃蛋白酶添加量1.59%、酶解時(shí)間43 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，膠原提取率為56.54%。可見(jiàn)，試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合良好，該方程能真實(shí)地反映各因素對(duì)膠原提取率的影響。

表1 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table1 Program and experimental results of response surface methodology

2.3 Ⅱ型膠原的SDS-PAGE電泳

圖11 Ⅱ型膠原的SDS-PAGE圖譜AGEFig.11 SDS-PAGE spectrum of type Ⅱ collagen

采用SDS-PAGE電泳對(duì)提取后Ⅱ型膠原的純度及分子質(zhì)量進(jìn)行了鑒定。由圖11所見(jiàn)，提取的Ⅱ型膠原在SDS-PAGE圖譜上出現(xiàn)了α、β 2個(gè)條帶，其分子質(zhì)量分別約為110 kD和220 kD。根據(jù)已有的資料[21-25]，在分子質(zhì)量約110 kD附近出現(xiàn)的條帶為膠原蛋白的α鏈；在220 kD附近出現(xiàn)的條帶是α鏈的二聚體，即β-鏈。這是典型的Ⅱ型膠原SDS-PAGE圖譜，圖譜上無(wú)其他雜帶，不同批次提取的膠原蛋白具有較高的純度。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用鹽酸胍和NaCl 2 種抽提方法去除雜蛋白，經(jīng)4 mol/L的鹽酸胍溶解處理后Ⅱ型膠原的提取率明顯高于NaCl鹽析。采用響應(yīng)面法優(yōu)化雞胸軟骨Ⅱ型膠原提取工藝，確定適宜提取工藝條件為：酶解溫度18 ℃、胃蛋白酶添加量1.59%、酶解時(shí)間43 h，在此條件下，Ⅱ型膠原提取率為56.54%，且保持著完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)酶解后制備的Ⅱ型膠原電泳圖譜出現(xiàn)α、β 2 條帶，無(wú)其他雜帶，Ⅱ型膠原純度較高。

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Preparation Technology of Collagen Type Ⅱ from Chicken Sternal Cartilage

CHENG Yuan CAO Hui*′XU Fei YU Jinsong YUAN Min (School of Medical Instruments and Food Engineering University of Shanghai for Science and Technology Shanghai 200093′China)

This paper reported the preparation of the type Ⅱ collagen from chicken articular cartilage Guanidine hydrochloride and NaCl were used to remove the contaminating proteins and the collagen was then digested with pepsin The study investigated effects of reaction temperature reaction time and concentration of enzyme on extraction efficiency The results showed that guanidine hydrochloride at 4 mol/L removed heteropolysaccharide effectively The optimal conditions for collagen type Ⅱ extraction were as follows temperature′18 ℃; gastric protein concentration′1.59%; and digestion time′43 h Under these conditions the extraction efficiency of collagen was 56.54%.

chicken stemal cartilage type Ⅱ collagen extract

TS251.94

A

1002-6630（2015）06-0024-05

10.7506/spkx1002-6630-201506005

2014-08-01

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201421）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102207）；上海市研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（JWCXSL1302）

程媛（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄耘淞霞疤砑觿?。E-mail：664039430@qq.com

*通信作者：曹慧（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄耘淞霞疤砑觿-mail：caohuian@126.com