化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片和小穗中的殘留消解動態(tài)

朱啟迪，翁群珠，張改生*，巨 嵐，張 姣，于永昂，趙卓軍，牛 娜，王軍衛(wèi)，馬守才

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心，國家小麥改良中 心楊凌分中心，小麥育種教育部工程研究中心，陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室，陜西 楊凌 7121 00）

化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片和小穗中的殘留消解動態(tài)

朱啟迪，翁群珠，張改生*，巨 嵐，張 姣，于永昂，趙卓軍，牛 娜，王軍衛(wèi)，馬守才

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心，國家小麥改良中 心楊凌分中心，小麥育種教育部工程研究中心，陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室，陜西 楊凌 7121 00）

建立化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片和小穗中殘留檢測的高效液相色譜法，并研究其在谷子葉片和小穗中的消解動態(tài)。樣品經(jīng)乙腈提取，N-丙基乙二胺凈化，外標(biāo)法定量。該檢測方法在1～1 000 mg/L范圍內(nèi)，化學(xué)雜交劑SQ-1質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=30 377x+27 634，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，最低檢出限為0.05 mg/kg。在10～500 mg/kg添加范圍內(nèi)，化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片和小穗中的平均回收率為 87.0%～95.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%～2.28%。結(jié)果表明：化學(xué)雜交劑SQ-1可以從谷子葉片運輸?shù)叫∷胫?，在小穗中的動態(tài)變化呈現(xiàn)出“先升高后降低”的趨勢。其在谷子葉片中的半衰期為1.83～2.08 d，在噴施21 d后葉片中幾乎檢測不到化學(xué)雜交劑SQ-1殘留，而在小穗中的半衰期為25.21～28.41 d，其消解速 度明顯慢于葉片中的消解速度。

谷子；化學(xué)雜交劑；殘留；消解動態(tài)；高效液相色譜

谷子是我國重要的糧食作物，同時又具有很好的營養(yǎng)保健功效。特別是其營養(yǎng)價值非常高，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸以及各種微量元素，在國外被譽為“營養(yǎng)之王”[1-4]。谷子還具有抗干旱、耐貧瘠、適應(yīng)性廣等優(yōu)良特點[5-8]，但與其他作物相比，谷子產(chǎn)量較低，不過谷子具有很強的雜種優(yōu)勢，尤其是谷子的繁殖系數(shù)高，可以通過雜交種來提高谷子的產(chǎn)量和品質(zhì)[9-10]。我國在谷子雜種優(yōu)勢利用方面給予了足夠的重視，并取得了很大的進(jìn)展，先后開展了“顯性雄性不育育種”[11]、“光溫敏不育兩系育種”[12-13]、“化學(xué)殺雄育種”[14]等方面的研究，其中化學(xué)殺雄具有選擇親本靈活，可以自由配制組合，無細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)等優(yōu)點[15-18]，具有很廣泛的應(yīng)用前景。

SQ-1是我國自主研制的一種新型化學(xué)雜交劑，主要應(yīng)用在小麥[19]、小黑麥[20]、谷子[14]、糜子[21]等糧食作物上，具有很好的殺雄效果，雄性不 育率能達(dá)到95%～100%。但是谷子噴施完化學(xué)雜交劑SQ-1后，其植株中是否有化學(xué)雜交劑SQ-1殘留以及化學(xué)雜交劑SQ-1的動態(tài)消解方面的研究，尚未見報道。目前，化學(xué)雜交劑SQ-1的提取方法主要有液-液萃取法[15]、固相萃取法[22]、分散固相萃取法[19]等，液-液萃取法和固相萃取法有機溶劑消耗量大、操作過程復(fù)雜、費力耗時等缺點，一般很少使用。本實驗采用分散固相萃取法提取化學(xué)雜交劑SQ-1，高效液相色譜法檢測了谷子葉片和小穗中化學(xué)雜交劑SQ-1殘留，并研究了其在谷子植株中的消解動態(tài)，旨在為化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子上的安全合理應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五九爪軟谷和榆林地方品種香谷由西北農(nóng)林科技大學(xué)柴巖教授提供；化學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)準(zhǔn)品由陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室提供；甲醇、乙腈（均為色譜純）、甲酸 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純）；分散凈化劑N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）；實驗用水美國Milli-poreco公司超純水系統(tǒng)所制純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-15C高效液相色譜儀（紫外-可見雙波長檢測器）、Wondasil C18色譜柱 日本島津科技有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Biocel超純水機 美國Milli-poreco公司；SK-1快速混勻器 常州國華電器公司；移液器 德國Eppendorf公司；Filter Unit濾膜（0.22 μm）。

1.3 方法

1.3.1 田間樣品處理和采集

實驗材料種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗田，參照雜交小麥大 田生產(chǎn)化學(xué)雜交劑SQ-1的噴施劑量，本實驗采用高劑量（5 kg/hm2）噴施，噴施時間為谷子八葉期，噴施部位為谷子葉片。采集噴施化學(xué)雜交劑6 h及1、3、6、10、21 d后的葉片和1、3、6、10、21 d后小穗，同時噴施相同體積的水作為空白對照。采用多點隨機取樣法采集樣品，用液氮迅速研磨樣品，磨碎后—20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g磨碎后的樣品于15 mL的帶蓋離心管中，加入4 mL水，超聲波提取10 min（功率400 W）。加入2 g硫酸鎂和0.2 g氯化鈉，然后在混勻器上充分混勻，再加入50 ?L甲酸和5 mL乙腈，劇烈振蕩1 min，8 000 r/min離心3 min。取1 mL上清液于2 mL離心管中，加入25 mg PSA，然后在混勻器上充分振蕩1 min，8 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 ?m濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：島津Wondasil C18（250 mm×4. 6 mm，5 μm）；流動性：V（甲醇）∶V（水）∶V（乙酸）= 70∶30∶0.1；流速：1 mL/min；柱溫度：25 ℃；紫外檢測波長：283 nm；進(jìn)樣量：20 ?L。

1.3.4 SQ-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液器準(zhǔn)確地移取適量的化學(xué)雜交劑SQ-1原藥，然后用超純水逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1、10、20、40、60、80、100、250、500、1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系、靈敏度、準(zhǔn)確度與精密度

按照1.3.3節(jié)色譜條件測定配制好的化學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)樣峰面積，以峰面積對溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，線性方程為y=30 377x+27 634（R2= 0.999 9），在1～1 000 mg/L范圍內(nèi)，化學(xué)雜交劑SQ-1質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，最低檢出限為0.05 mg/kg（按RSN=3計算）。

取1 g谷子葉片空白樣品，分別添加10、100、500 mg/kg三個水平的化學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行添加回收率實驗，每個添加水平重復(fù)6 次，取1 g谷子小穗空白樣品，分別添加10、25、50 mg/kg三個水平的化學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行添加回收率實驗，每個添加水平重復(fù)6 次，按照上述前處理方法和色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表1?；瘜W(xué)雜交劑SQ-1在葉片和小穗中的回收率為87.0%～95.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%～2.28%，符合農(nóng)藥殘留檢測分析的標(biāo)準(zhǔn)?；?學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)準(zhǔn)樣品、谷子葉片空白樣品和空白樣品添加化學(xué)雜交劑SQ-1的色譜圖見圖1。

表1 化學(xué)雜交劑SQ-1的添加回收率Table1 Recoveries of chemical hybridizing agent SQ-1 in spiked samples

圖1 SQ-1（100 mg/kg）（A）、空白葉片（B）和添加SQ--11（100 mg/kg）葉片（C）色譜圖Fig.1 Chromatograms of SQ-1 (100 mg/kg) (A), blank leaves (B) and leaves spiked with SQ-1 (100 mg/kg) (C)

2.2 化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片中的消解動態(tài)

圖2 化學(xué)雜交劑在谷子葉片中的消解動態(tài)Fig.2 Dynamic degradation curves of chemical hybridizing agent SQ-1 in foxtail millet leaves

谷子噴施化學(xué)雜交劑SQ-1后，在不同時間采樣進(jìn)行殘留量測定分析。由圖2可知：化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片中的殘留量隨著時間的延長而逐漸降低，其消解動態(tài)符合一級動力學(xué)方程。香谷在噴施6 h后葉片含量比較高，但是其消解速率比較快，它的消解曲線方程為C = 1.344e—0.36t，相關(guān)系數(shù)R2= 0.993，半衰期為t1/2= 1.83 d。五九爪軟谷在噴施6 h后葉片含量比較低，但是其消解速率稍慢，它的消解曲線方程為C = 0.884e—0.35t，相關(guān)系數(shù)R2= 0.952，半衰期為t1/2= 2.08 d。

2.3 化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子小穗中的消解動態(tài)

在谷子噴施化學(xué)雜交劑SQ-1后，運輸?shù)焦茸有∷胫行枰粋€過程，由圖3可知，剛開始幾天檢測時其含量呈上升趨勢，然后隨著時間的延長又逐漸下降，其消解動態(tài)符合一級動力學(xué)方程，在香谷和五九爪軟谷中消解曲線方程分別為C=168.4e—0.04t（R2= 0.992）；C=128.2e—0.03t（R2= 0.948），降解半衰期分別為2 5.21 d和28.41 d。化學(xué)雜交劑SQ-1在香谷小穗中6 d后開始降解，而在五九爪軟谷中3 d后就開始降解，這可能與谷子品種的特異性相關(guān)。

圖3 化學(xué)雜交劑在谷子小穗中的消解動態(tài)Fig.3 Dynamic degradation curves of chemical hybridizing agent SQ-1 in foxtail millet spikelets

3 結(jié) 論

本實驗建立了檢測谷子葉片和小穗中化學(xué)雜交劑SQ-1殘留的高效液相色譜法，前處理方法在QuEChERS方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，操作簡單快捷，極大地提高了檢測效率，完全符合農(nóng)藥殘留分析的要求。研究結(jié)果表明：化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片的降解速度比較快，半衰期為1.83～2.08 d，而在谷子小穗中的降解速度比較緩慢，半衰期為25.21～28.41 d，呈現(xiàn)出“先增加后降低”的動態(tài)變化，它可以從谷子葉片運輸?shù)焦茸有∷胫?，并在谷子小穗中積累然后隨著時間的延長逐漸降解?；瘜W(xué)雜交劑SQ-1噴施21 d后谷子葉片中幾乎檢測不到其殘留，而小穗中還能檢測到殘留，一方面可能是因為噴施的劑量大于正常的劑量，從葉片運輸?shù)叫∷胫械幕瘜W(xué)雜交劑SQ-1比較多，另一方面是因為化學(xué)雜交劑SQ-1在小穗中降解比較緩慢。

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Residues and Decline of Chemical Hybridizing Agent SQ-1 in Leaves and Spikelets of Foxtail Millet

ZHU Qidi, WENG Qunzhu, ZHANG Gaisheng*, JU Lan, ZHANG Jiao, YU Yong’ang,
ZHAO Zhuojun, NIU Na, WANG Junwei, MA Shoucai (Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province, Wheat Breeding Engineering Research Center, Ministry of Education, Yangling Branch of State Wheat Improvement Center, National Yangling Agricultural Biotechnology & Breeding Center, College of Agriculture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

A high performance liquid chromatography method was developed for determining chemical hybridizing agent SQ-1 and its dissipation curve in leaves and spikelets of foxtail millet. The samples were extracted with acetonitrile, cleaned up with N-propylethylenediamine (PSA) and quantified by the external standard method. There was a good linear relationship between the peak area and concentration of SQ-1 over the range from 1 to 1 000 mg/L, and the linear equation was y = 30 377x + 27 634, with a correlation coefficient of 0.999 9. T he lowest detectable concen tration was 0.05 mg/kg. The mean recoveries of SQ-1 in leaves and spikelet of foxtail millet varied from 87.0% to 95.5% with a relative standard deviation ranging from 0.74% to 2.28% at fortification levels of 10–500 mg/kg. The results indicated that SQ-1 could be transported from leaves to spikelets. The trend of SQ-1 residual dynamics was first increased and then decreased. The halflives of SQ-1 were 1.83–2.08 days in leaves and no SQ-1 pesticide residues were detected after 21 days. The half-lives of SQ-1 were 25.21–28.41 days in spikelets, and its degradation rate in spikelets was significantly lower than in leaves. Key words: foxtail millet; chemical hybridizing agent; residues; degradation kinetics; high performance liquid chromatography (HPLC)

S482.8

A

1002-6630（2015）04-0181-04

10.7506/spkx1002-6630-201504035

2014-03-25

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA10A106）；國家自然科學(xué)基金重大項目（311 71611；31371697）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃課題（2014KTZB02-01-02）

朱啟迪（1984—），男，博士研究生，研究方向為作物雄性不育機理。E-mail：zzhhqqdd@163.com

*通信作者：張改生（1951—），男，教授，博士，研究方向為作物雜種優(yōu)勢研究與利用。E-mail：zhanggsh58@aliyun.com