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    銀耳干品的DNA提取及隨機擴增多態(tài)性分 析

    2015-12-13 07:02:29王凡華馬務迢譚慶云劉偉賢楊公明易繼財
    食品科學 2015年4期
    關(guān)鍵詞:干品銀耳多態(tài)性

    王凡華,馬務迢,譚慶云,劉偉賢,孫 恬,杜 冰,楊公明,易繼財,*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,廣東省普通高等學校植物功能基因組與生物技術(shù)重點實驗室,廣東 廣州 510642;2.無限極(中國)有限公司,廣東 江門 529156;3.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東 廣州 510642)

    銀耳干品的DNA提取及隨機擴增多態(tài)性分 析

    王凡華1,馬務迢2,譚慶云1,劉偉賢2,孫 恬2,杜 冰3,楊公明3,易繼財1,*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,廣東省普通高等學校植物功能基因組與生物技術(shù)重點實驗室,廣東 廣州 510642;2.無限極(中國)有限公司,廣東 江門 529156;3.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東 廣州 510642)

    銀耳子實體中因含有大量的多糖和蛋白質(zhì),嚴重干擾其基因組DNA的提取。本實驗建立一種銀耳干品(子實體)中DNA的提取方法,利用此法可直接以銀耳干品為材料提取DNA,不需芽孢分離和菌絲培養(yǎng)步驟,而且DNA產(chǎn)量高、質(zhì)量好,可用于隨機擴增多態(tài)性(random amplified poly morphic,RAPD)DNA分析。RAPD分析的結(jié)果顯示,本實驗所選取的銀耳樣品間存在DNA多態(tài)性。研究結(jié)果將有助于當前食品分析檢測中直接以銀耳干品為材料進行DNA提取及品種鑒別等分析工作。

    銀耳干品;DNA提??;隨機擴增多態(tài)性DNA;品種鑒別

    銀耳(Tremella fuciformis Berk.)又稱白木耳,為我國傳統(tǒng)名貴食用菌?,F(xiàn)代研究[1-3]表明,銀耳富含多糖及其它營養(yǎng)活性成分,具有提高人體免疫力、延緩衰老及抗腫瘤等多種作用。隨著人們生活水平不斷提高,保健意識逐漸加強,人們對銀耳的需求也逐年增加[4]。

    在銀耳實際生產(chǎn)中,商家往往出于商業(yè)利益隨意更改菌名而導致的“同名異種”和“同種異名”問題較嚴重,同時也出現(xiàn)由于長期人工選擇及地區(qū)間引種導致銀耳的遺傳背景越來越單一及品種退化的問題,從而要求對銀耳種質(zhì)、遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行準確鑒定[5-6]。此外,在銀耳的栽培中,目前以棉籽殼為主要原料,而我國棉花種植面積中約70%都是抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花[7],使用轉(zhuǎn)基因棉籽殼種植銀耳已是很難避免的問題。銀耳生長過程中,菌絲附著在棉籽殼上吸收大量水分和養(yǎng)料,那么棉籽殼中的轉(zhuǎn)基因成分是否隨水分和養(yǎng)料的運輸向銀耳子實體飄移而造成轉(zhuǎn)基因生物安全性問題是目前迫切需要研究的課題[8-10]。通過對銀耳干品的DNA進行以聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)為基礎的分子標記鑒定及轉(zhuǎn)基因成分檢測是解決目前這些問題的有效方法。

    銀耳屬于膠質(zhì)菌,其子實體由數(shù)片薄而多皺褶的扁平狀瓣片組成,脫水后收縮,呈角質(zhì)化且硬而脆[1]。根據(jù)已有的文獻報道[6,8,11],膠質(zhì)菌富含多糖和蛋白質(zhì),其DNA的提取主要以芽孢或菌絲體為材料,此類方法雖然提取的DNA含量可能高于本研究方法,但需進行芽孢分離或菌絲培養(yǎng)的過程,不僅繁瑣,且不能對銀耳干品實行檢測,而目前尚未見直接以銀耳干品為材料進行DNA提取及相關(guān)分析的報道。

    本研究根據(jù)已報道的銀耳芽孢或菌絲體DNA的提取方法進行改良和優(yōu)化,建立一種直接提取銀耳耳片(子實體)干品中DNA的方法,無需芽孢分離或菌絲培養(yǎng)的中間步驟,從而為下一步直接對銀耳成品進行品種鑒別及轉(zhuǎn)基因成分檢測等分析提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    所用材料為福建省古田縣的“古田銀耳”,當?shù)厮追Q“黃菇”,分別取自大橋村(樣品A)、吉兆村(樣品B)及古田縣批發(fā)市場(樣品C)。

    質(zhì)量分數(shù)2%十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)抽提液:100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane,Tris)-鹽酸(pH 8.0)、50 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)-2Na(pH 8.0)、500 mmol/L NaCl、質(zhì)量分數(shù)2% SDS。

    質(zhì)量分數(shù)2%溴化十六烷基三甲基銨(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)抽提液:100 mmol/L Tris-鹽酸(pH 8.0)、20 mmol/L EDTA-2Na、1.4 mol/L NaCl、質(zhì)量分數(shù)2% CTAB、質(zhì)量分數(shù)2%聚乙烯吡咯烷酮(poly vinyl pyrrolidone,PVP)。

    質(zhì)量分數(shù)5% CTAB抽提液:100 mmol/L Tris-鹽酸(pH 8.0)、20 mmol/L EDTA-2Na、1.4 mol/L NaCl溶液、質(zhì)量分數(shù)5% CTAB、質(zhì)量分數(shù)2% PVP。

    脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTP)、Taq DNA聚合酶、DNA分子質(zhì)量標準品 日本Takara公司;瓊脂糖 西班牙Biowest公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設備

    5417R/5810R常溫/冷凍離心機 德國Eppendrorf公司;Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)、PowerPacTMBasic型電泳儀 美國Biorad公司;NanoDrop 1000型紫外-可見分光光度計 美國Thermo Scientific公司;E-2369型PCR儀 日本TaKaRa公司。

    1.3 方法

    1.3.1 銀耳耳片干品的預處理

    用蒸餾水將銀耳干品泡發(fā)0.5 h,令其充分吸脹,取出晾干或吸水紙吸干表面水分,保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 銀耳干品的基因組DNA提取方法

    1.3.2.1 SDS法根據(jù)唐良華[12]、李剛[13]等方法,并加以改良。稱取已泡發(fā)處理的1.0 g銀耳置于研缽中,加入適量液氮及0.1 g PVP,研磨均勻,然后迅速轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管中,立即加入 1 mL 65 ℃預熱的質(zhì)量分數(shù)2% SDS抽提液,混勻后置于65 ℃水浴60~90 min(期間間隔5 min搖動1 次)。12 000 r/min離心10 min,吸取上清液至新的離心管中。加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶l,V/V),輕搖15 min,室溫靜置5 min后12 000 r/min離心10 min,吸取上層水相至新的離心管中。向離心管中加入等體積氯仿-異戊醇(24∶l,V/V),輕搖10 min,室溫靜置5 min后12 000 r/m in離心10 min,吸取上層水相至新的離心管并加入氯仿 -異戊醇溶液,重復前述操作3~4 次直至水相與有機相之間的中間層無雜質(zhì),最后小心吸取上層水相至新的離心管中,按1∶10(V/V)加入3 mol/L NaAc及2 倍體積的無水乙醇,混勻后放置于—20 ℃條件下沉淀30 min。12 000 r/min離心10 min,棄上清液,DNA沉淀用70%乙醇洗滌2 次,打開管蓋,室溫放置15 min。待酒精揮發(fā)完全后,向管中加入50 μL含10 mg/mL RNA酶A的Tris-EDTA溶液,37℃放置30 min溶解DNA,—20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2.2 質(zhì)量分數(shù)2% CTAB法

    根據(jù)劉娟[11]、王藝紅[14]等方法,并加以改良。稱取已泡發(fā)處理的1.0 g銀耳置于研缽中,加入適量液氮及0.1 g PVP,研磨均勻,然后迅速轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管中,立即加入1 mL 65 ℃預熱的質(zhì)量分數(shù)2% CTAB抽提液,余下步驟與1.3.2.1節(jié)SDS法相同。

    1.3.2.3 質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法

    根據(jù)臧金平[15]、白永宏[16]等方法,并加以改良。稱取已泡發(fā)處理的1.0 g銀耳置于研缽中,加入適量液氮及0.1 g PVP,研磨均勻,然后迅速轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管中,立即加入1 mL 65℃預熱的質(zhì)量分數(shù)5% CTAB,其余步驟與1.3.2.1節(jié)SDS法相同。

    為提高基因組DNA提取的最終質(zhì)量濃度,在上述3 種方法中,每個樣品適當做3~5 個重復,然后將氯仿-異戊醇溶液純化步驟后的水相溶液合并沉淀。

    1.3.3 DNA質(zhì)量濃度測定及電泳檢測

    利用紫外分光光度計測定DNA溶液在波長260 nm和280 nm處的吸光度,計算出A260nm/A280nm比值及DNA質(zhì)量濃度[11]。實驗重復3 次。

    取2.0 μL DNA溶液,以質(zhì)量分數(shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量濃度。

    1.3.4 RAPD擴增反應

    參考汪小全[17]、詹才新[18]等方法,并稍加修改。隨機擴增多態(tài)性(random amplified polymorphic,RAPD)DNA擴增反應的隨機引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,引物序列:S1(5’-GTTTCGCTCC-3’)、S2(5’-TCACGTCCAC-3’)和S3(5’-CAAGCGTCAC-3’)。RAPD擴增反應體系:100 ng模板DNA,0.1 μmol/L隨機引物,0.1 mmol/L dNTPs,1.0 U Taq酶,最后加ddH2O補齊至總體積為25 μL。RAPD擴增反應參數(shù):94 ℃、5 min;94 ℃、40 s;36 ℃、40 s;72 ℃、1 min;35 個循環(huán);72 ℃、10 min。RAPD擴增反應的產(chǎn)物以質(zhì)量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DNA的電泳檢測及質(zhì)量濃度測定

    圖1 3 種不同方法提取銀耳樣品A的DNA電泳Fig.1 Electrophoresis of DNA extracted from Tremella fuciformis A by three different methods

    從圖1可知,3 種方法提取的DNA均無明顯的RNA條帶,其中質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法提取到的銀耳DNA條帶單一、亮度最高且無嚴重拖尾,表明此法提取的DNA含量最高,且DNA未發(fā)生降解,也無明顯的RNA污染。質(zhì)量分數(shù)2% CTAB法提取的DNA電泳雖然也呈單一條帶且無拖尾現(xiàn)象,但其亮度比質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法低得多。SDS法提取的DNA條帶幾乎看不到,且DNA溶液黏稠,表明此法提取的DNA不僅含量極少,而且多糖的比例也很高。表1也顯示,在3 種提取方法中,質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法提取到的DNA質(zhì)量濃度最高,達到0.165 μg/μL,而且其A260nm/A280nm的比值在1.8~2.0之間,表明其純度也符合要求;質(zhì)量分數(shù)2% CTAB法提取的DNA純度雖然符合要求,但是其質(zhì)量濃度僅為0.015 μg/μL;而SDS法提取的DNA可能由于多糖含量太高,導致無法準確測定其吸光度。

    表1 3 種不同方法提取銀耳樣品A的DNA純度及質(zhì)量濃度測定Table1 Concentrations and purities of DNA extracted from Tremella fuciformismis A by three different methods s

    結(jié)果表明,由于銀耳耳片膠質(zhì)物含量太高,導致SDS法未能從銀耳子實體干品中抽提出DNA;質(zhì)量分數(shù)2% CTAB法雖可抽提出DNA,但得到的DNA質(zhì)量濃度非常低;而利用質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法提取的銀耳DNA不僅質(zhì)量濃度最高,而且純度符合要求,因此采用質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法對樣品B和樣品C進行DNA抽提與檢測(圖2、表2)。從圖2可知,各個銀耳樣品中抽提的DNA均呈單一清晰條帶,無嚴重拖尾,且無明顯的RNA條帶,表明DNA均未發(fā)生降解,RNA污染也較少。表2顯示各個樣品的DNA質(zhì)量濃度在0.098~0.165 μg/μL之間,且A260nm/A280nm比值均在1.8~2.0之間。此結(jié)果表明質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法適用于各種不同銀耳樣品干品的DNA提取,且都能得到較高質(zhì)量的DNA。

    圖2 質(zhì)量分數(shù)55% CTAB法提取3 種銀耳樣品的DNAA電泳Fig.2 Electrophoresis of DNA extracted from Tremella fuciformis by 5% CTAB method

    表 22 55% CTAB法提取3 個銀耳樣品的DNA純度及質(zhì)量濃度測定Table 2 Conncentrations and puritties of DNA extracted fromTremella fuciformmiiss bbyy 55% CTAB methhoodd

    2.2 RAPD DNA分子標記分析

    運用RAPD分子標記分析,可檢測抽提的基因組DNA質(zhì)量是否滿足PCR擴增的需要,同時可檢測樣品DNA之間的多態(tài)性[19-20]。從圖3可知,3 種隨機引物對不同樣品的DNA均能成功實現(xiàn)RAPD PCR擴增,擴增出的條帶大小在500~2 000 bp之間,而且經(jīng)3 次以上重復,所有引物對每個樣品DNA擴增均能得到1~3 條清晰的主帶,表明質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法抽提的DNA質(zhì)量較好,能夠滿足以PCR技術(shù)為基礎的RAPD分析需求。此外,從圖3可知,每種引物擴增,3 個銀耳樣品DNA的條帶數(shù)都不相同,表明這3 個銀耳樣品間存在DNA多態(tài)性,此結(jié)果表明,本實驗所選銀耳樣品雖然都是“古田銀耳”,但是可能因為不同種植地點的DNA變異積累不同或者遺傳本質(zhì)上屬于不同的品種,導致銀耳樣品基因組DNA間存在RAPD多態(tài)性。

    圖3 不同銀耳樣品DNA的RAPDD分析Fig.3 RAPD analysis of DNA extracted from different Tremella fuciformis samples

    3 結(jié)論與討論

    本研究根據(jù)文獻報道及銀耳子實體的特點,建立了3 種直接從銀耳耳片(子實體)干品中提取DNA的方法,并對其抽提DNA的效果進行比較,結(jié)果表明質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法提取的銀耳DNA質(zhì)量最好,利用此法提取的各種銀耳樣品的DNA均能適用于RAPD擴增反應。

    銀耳中因膠質(zhì)物(主要為多糖和蛋白質(zhì))含量太多,導致難以從中提取出高質(zhì)量的DNA,因此前人一般先通過分離和培養(yǎng)銀耳的芽孢或菌絲,然后從中提取DNA[5,11]。本研究中質(zhì)量分數(shù)5% CTAB法,主要在以下方面進行了改進:

    1)由于銀耳干品加石英砂很難保證研磨充分、加液氮冷凍后反而更難研磨,本研究經(jīng)過摸索發(fā)現(xiàn),將銀耳干品泡發(fā)0.5 h后再加入液氮冷凍研磨,可保證銀耳組織研磨充分均勻;2)在研磨時就加入PVP,使得PVP及早結(jié)合酚類物質(zhì)[21],減少多酚類物質(zhì)的干擾;3)CTAB能有效沉淀多糖[22],因此將抽提液中CTAB的含量提高至質(zhì)量分數(shù)5%,以盡量減少多糖的干擾;4)通過將樣品多個重復的DNA溶液合并及再純化,以提高最終DNA的含量和純度,保證RAPD擴增反應等分子分析的順利進行。

    通過以上措施,盡量避免膠質(zhì)物的干擾,可抽提出高質(zhì)量DNA。本實驗方法不僅適用于銀耳子實體干品中DNA的提取,也可為銀耳新鮮子實體及其他膠質(zhì)菌子實體中DNA的提取提供參考。

    銀耳子實體的形態(tài)分化較簡單,以形態(tài)特征為依據(jù)進行菌株或品種的區(qū)分較困難,商業(yè)利益的驅(qū)動也常導致“同名異種”和“同種異名”的現(xiàn)象較嚴重[23-24]。本研究對古田縣3 個不同地點采集的“古田銀耳”(當?shù)厮追Q“黃菇”)進行了RAPD分子標記初步分析,發(fā)現(xiàn)3 個銀耳樣品的基因組DNA間存在多態(tài)性,顯示不同樣品的DNA堿基序列存在差異,證明當?shù)劂y耳品種間的遺傳背景可能有差異,可能存在“同名異種”問題。此外,本研究報道的方法可直接從銀耳子實體干品提取DNA,即可實現(xiàn)隨時取樣隨時提取DNA便于分析檢測,從而滿足當前食品分析檢測中要求以銀耳成品(干品)為材料進行品種鑒別,來解決“同種異名”或“同名異種”問題的需要[25],也可滿足目前以棉籽殼為主要栽培料的銀耳成品中轉(zhuǎn)基因成分檢測的需要。本課題組正利用建立的方法對采集的銀耳樣品抽提DNA,以進行分子標記分析和轉(zhuǎn)基因成分檢測,相關(guān)結(jié)果將另文發(fā)表。

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    DNA Extraction for RAPD Analysis of Dried Tremella fuciformis

    WANG Fanhua1, MA Wutiao2, TAN Qingyun1, LIU Weixian2, SUN Tian2, DU Bing3, YANG Gongming3, YI Jicai1,*
    (1. Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Biotechnology of Guangdong Provincial Higher Education Insititutions, College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Infinitus (China) Co. Ltd., Jiangmen 529156, China; 3. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

    It is difficult to extract genomic DNA from Tremella fuciformis due to the disturbance of abundant polysaccharides and proteins. In this paper, a method is reported to directly extract DNA from dried Tremella fuciformis without spore separation or mycelium culture procedures which enables one to achieve high-quality DNA in a high yield for RAPD (random amplified polymorphic DNA) analysis. The RAPD results indicated the presence of DNA polymorphisms in the tested samples. The results of this study will contribute to DNA extraction and variety identification of dried Tremella fuciformis in food analysis and detection.

    dried Tremella fuciformis; DNA extraction; random amplified polymorphic (RAPD) DNA; variety identification

    Q7

    A

    1002-6630(2015)04-0172-04

    10.7506/spkx1002-6630-201504033

    2014-06-13

    無限極(中國)有限公司項目(HPG/2013/05/0604)

    王凡華(1992—),女,碩士研究生,研究方向為生化與分子生物學。E-mail:fanhua_wang@sina.cn

    *通信作者:易繼財(1971—),男,副教授,博士,研究方向為生化與分子生物學。E-mail:jicai@scau.edu.cn

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