超聲波輔助 消化-石墨爐原子吸收法快速測(cè)定海參中總釩和有機(jī)釩含量

劉炎峻，徐 杰，周慶新，薛 勇，薛長(zhǎng)湖*，王靜鳳

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

超聲波輔助 消化-石墨爐原子吸收法快速測(cè)定海參中總釩和有機(jī)釩含量

劉炎峻，徐 杰，周慶新，薛 勇，薛長(zhǎng)湖*，王靜鳳

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

建立超聲波輔助消化-石墨爐原子吸收法快速測(cè)定海參中釩元素的方法。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)選擇適宜超聲波消化時(shí)間30 min與超聲波水浴溫度60 ℃，以及最佳的原子吸收條件（灰化溫度900 ℃、原子化溫度2 700 ℃、灰化時(shí)間20 s、原子化時(shí)間5 s），實(shí)現(xiàn)了海參樣品的快速消化，使金屬元素快速釋放，并成功應(yīng)用到海參中釩含量的測(cè)定。方法加標(biāo)回收率在94.2%～105.4%之間，檢出限為1.44×10－3μg/mL，符合測(cè)定要求。在選定的工作條件下測(cè)定，結(jié)果表明中國(guó)南北方產(chǎn)地的仿刺參總釩和有機(jī)釩含量分別為0.27～1.43 μg/g和0.22～1.08 μg/g，具有明顯的差異性，并且60.4%～85.7%的釩以有機(jī)釩形式存在。14 種海參的有機(jī)釩分析發(fā)現(xiàn)，糙海參有機(jī)釩含量最高，達(dá)2.56 μg/g。海參中的總釩及其有機(jī)釩含量受品種、采樣地點(diǎn)和環(huán)境的影響。超聲波輔助消化-原子吸收法測(cè)定海參中釩元素快速、穩(wěn)定，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

釩；海參；有機(jī)化程度；超聲波輔助消化-石墨爐原子吸收光譜法

釩是人體及其他動(dòng)物必需的一種微量元素，具有多種生物學(xué)功能。1980年Schecher等[1]首先發(fā)現(xiàn)VO2＋有很好的類胰島素活性，使釩化合物開(kāi)始作為一個(gè)潛在的藥物而受到關(guān)注[2]，同時(shí)近年來(lái)不斷證明無(wú)機(jī)釩鹽以及釩配合物均具有明顯的降血糖作用[3-4]。生物體中含量較少，但是幾乎所有動(dòng)物體內(nèi)都可以證實(shí)釩的存在，而海產(chǎn)品的含釩量最高[1]，尤其是大量食沉積物的底棲動(dòng)物，如棘皮動(dòng)物的海參類、海鞘類等[5]。

海參是棘皮動(dòng)物門海參綱動(dòng)物的統(tǒng)稱，海參綱約有900多個(gè)種類，全部生活在海洋中，世界上可以食用的海參有40 種左右，如海參屬（Holothuria）、刺參屬（Stichopus）等。海參高蛋白質(zhì)，低脂肪，不含膽固醇，富含多種氨基酸、維生素和鋅、鐵、硒等人體普遍缺乏的多種微量元素[6]。劉小芳等[7]采用電感耦合-等離子體原子發(fā)射光譜（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）法分析表明，海參體壁釩含量3.51 mg/kg，而內(nèi)臟中可達(dá)18.48 mg/kg，約為體壁釩含量的5 倍，經(jīng)過(guò)對(duì)比海參所含有的釩，屬諸食品之首，海參內(nèi)臟釩的含量極高，在治療糖尿病以及調(diào)節(jié)糖代謝和脂質(zhì)代謝方面應(yīng)有較好的研究?jī)r(jià)值。無(wú)機(jī)釩的生物活性低，而且難以吸收，因此具有物活性的有機(jī)釩是目前釩應(yīng)用方面研究的熱點(diǎn)。

測(cè)定釩的方法主要有分光光度法[8]、電位滴定法[9]、石墨爐原子吸收（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS）法[10]、ICP-AES法等[11]。GFAAS法具有靈敏度高、需要樣品量少、分析速度快、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于微量元素的測(cè)定中[12]。消化食品傳統(tǒng)的方法有干法灰化、濕法消化、高壓消解和微波消解法等[13]，幾種方法各有優(yōu)劣，干法灰化前處理周期較長(zhǎng)；濕法消化要用到大量硝酸、高氯酸等試劑；高壓消解所需時(shí)間較長(zhǎng)，而微波消解需要有專門的較昂貴的設(shè)備支持；超聲波輔助消化（ultrasound-assisted digestion，UAD）的原理是當(dāng)超聲波施加到分散在液體介質(zhì)中的細(xì)粉狀固體時(shí)，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)就會(huì)促進(jìn)提取，溶解和消化過(guò)程[14]?？栈瘹馀菰诠?液界面塌陷的同時(shí)產(chǎn)生大量的能量并且釋放，造成沖擊波以及局部非常高的溫度和壓力，其導(dǎo)致的結(jié)果有：1）高壓提高了溶劑的滲透性和運(yùn)輸；2）固體顆粒破碎，增大了與萃取劑的接觸面積，提高萃取劑的浸出金屬的能力[15]；3）促進(jìn)氧化物質(zhì)（如過(guò)氧化氫和羥自由基）的形成，協(xié)助有機(jī)物的氧化[16]。UAD的優(yōu)點(diǎn)為條件溫和（接近室溫和大氣壓力下）、污染最小、試劑消耗低、消化時(shí)間極短[17-20]。由于海參含有較多復(fù)雜的有機(jī)和無(wú)機(jī)組分，并且干燥之后的海參樣品結(jié)構(gòu)緊密，傳統(tǒng)的消解方式并不利于海參無(wú)機(jī)元素的釋放，因此引入U(xiǎn)AD用于海參樣品釩的消化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集產(chǎn)自大連獐子島、煙臺(tái)蓬萊、山東青島、山東威海、遼寧盤錦、煙臺(tái)牟平、福建霞浦、浙江溫州的仿刺參干品各10 只（捕獲時(shí)間2013年11月），另購(gòu)買分屬刺參科、海參科、瓜參科、蝶參科和尻參科的墨西哥等刺參、美國(guó)肉參、加州擬刺參、南非花刺參、梅花參、革皮氏海參、北極海參、糙海參、黃乳海參、白底輻肛參、圖紋白尼參、北大西洋瓜參、長(zhǎng)尾蝶參、白肛海地瓜14 種海參干品。

釩單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL） 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；4-（2-吡啶偶氮）-間苯二酚、硝酸、高氯酸、過(guò)氧化氫（H2O2，30%）均為國(guó)產(chǎn)分析純；透析袋（3.5 kD） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；所有玻璃器皿浸泡在25%的硝酸溶液24 h以上，用去離子水漂洗3 次，并儲(chǔ)存在密封的容器中以避免污染。

1.2 儀器與設(shè)備

AA-6800F原子吸收分光光度計(jì)（配有GFA-EX7石墨爐原子化器、熱解涂層石墨管和ASK-6100自動(dòng)采樣器）日本島津公司；釩元素空心陰極燈 北京曙光明電子照明儀器有限公司；KQ-600KDE臺(tái)式高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HJ2雙頭加熱磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；ED36智能電熱消解爐 萊伯泰科有限公司；ALPHA 1-4 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；Unique-R20多功能超純水系統(tǒng)上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助消化條件

海參干粉（1.0 g）用15 mL硝酸-過(guò)氧化氫（4∶1，V/V）混合液浸漬于燒瓶中，密封后浸入超聲波水浴中，60 ℃條件下超聲處理30 min。冷卻至室溫后，4 000 r/min離心分離，將上清液轉(zhuǎn)移到消解管中。接著通過(guò)使用電熱消解爐80 ℃，10 min；100 ℃，10 min；160 ℃，10 min的加熱條件進(jìn)行趕酸消化以去除溶液中的氮氧化物、氟化物以及酸類。消化液用加入了0.1 mol/L乙二胺四乙酸的1% HCl溶液定容至10 mL，最后進(jìn)行原子吸收測(cè)定，同時(shí)做樣品空白溶液。

1.3.2 原子吸收條件

在整個(gè)加熱程序中（除了霧化階段），氬氣以1.0 L/min的恒定流量被通入。20 μL空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品空白和樣品溶液通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器分別注入石墨管中并加熱。為研究最佳的原子吸收條件，以山東威海仿刺參干粉為待測(cè)樣品，取樣量1.0 g，加標(biāo)量40 ng/mL，以加標(biāo)回收率為指標(biāo)，對(duì)灰化溫度、灰化時(shí)間、原子化溫度、原子化時(shí)間，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。

1.3.3 方法驗(yàn)證

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

在上述優(yōu)化后已確定的最佳消化和檢測(cè)條件下，以1% HCl溶液為空白對(duì)照，利用釩單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）配制系列稀釋釩標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 ng/mL），測(cè)定6 次其對(duì)應(yīng)的吸光度，并對(duì)空白樣品進(jìn)行11 次的重復(fù)測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 回收率實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確度，將海參樣品分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，采用UAD-GFAAS法測(cè)定釩含量，分析其回收率。

1.3.4 樣品處理

1.3.4.1 總釩樣品液制備

每個(gè)海參樣品設(shè)置6 個(gè)平行樣（n=6），測(cè)定數(shù)據(jù)為6 次測(cè)定的平均值。用超純水將海參體壁洗凈，冷凍干燥，并利用粉碎機(jī)粉碎成干粉，用UAD-GFAAS法進(jìn)行消化并測(cè)定總釩的含量。

1.3.4.2 有機(jī)釩樣品液制備

參照Alzate等[21]的研究，將冷凍干燥，粉碎磨細(xì)后的海參體壁干粉（1.0 g）溶解于超純水中，并轉(zhuǎn)移到透析袋（截留分子質(zhì)量3.5 kD），4 ℃條件下用超純水透析48 h，每12 h更換透析外液。將透析后的海參溶液冷凍干燥至質(zhì)量恒定，采用UAD-GFAAS法測(cè)定有機(jī)釩的含量。

1.3.4.3 海參釩的有機(jī)化程度計(jì)算

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用方差分析進(jìn)行分析。正交試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并計(jì)算K、k和R值。所有海參樣品重復(fù)進(jìn)行消化和分析3 次取平均值，含量結(jié)果以±s（n = 3）的方式給出。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助消化條件的選擇

圖1 超聲波輔助消化時(shí)間的優(yōu)化Fig.1 Optimization of ultrasound-assisted digestion time

為提高對(duì)樣品的消化能力，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入硝酸與H2O2分別作為消化劑以及氧化劑[22]，硝酸-H2O2（4∶1，V/V）。以釩回收率為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)優(yōu)化超聲波浴的處理時(shí)間和水浴溫度，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。UAD方法共需60 min。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，水浴溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，海參樣品中的釩提取完全。水浴溫度高達(dá)80 ℃時(shí)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的泡沫，可能導(dǎo)致金屬元素的揮發(fā)或損失，因此選擇60 ℃作為合適的水浴溫度。

圖2 超聲波輔助消化水浴溫度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of ultrasound-assisted digestion temperature

2.2 原子吸收條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

GFAAS分析方法中，灰化溫度、灰化時(shí)間、原子化溫度和原子化時(shí)間等工作參數(shù)，通常是影響定量檢測(cè)最重要的因素[23]。采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)石墨爐原子吸收的最佳條件進(jìn)行優(yōu)化。以釩的回收率作為因變量，正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1 Orthogonal array design and results

由表1可知，原子化溫度是影響釩定量測(cè)定的最重要因素，而影響釩定量檢測(cè)的4 個(gè)因素順序如下：C＞D＞A＞B。最適宜的石墨爐原子吸收工作條件A2B2C3D2即灰化溫度900 ℃、灰化時(shí)間20 s、原子化溫度2 800 ℃、原子化時(shí)間5s。然而，考慮到原子化溫度2 700 ℃和2 800 ℃之間的差距，為了降低石墨管的消耗，最佳的工作條件為A2B2C2D2，即灰化溫度900℃、灰化時(shí)間20 s、原子化溫度2 700 ℃、原子化時(shí)間5 s。GFAAS的最佳工作條件為燈電流10.0 mA、波長(zhǎng)318.4 nm、狹縫寬度0.5 nm、積分時(shí)間0.5 s、進(jìn)樣體積20 μL，控溫程序見(jiàn)表2。

表2 石墨爐原子吸收控溫工作條件Table2 Operating parameters of GFAAS

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與精密度

在上述GFAAS最佳工作條件下，通過(guò)依次測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 ng/mL）的吸光度，從而得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：A = 0.005 69x—0.001 42，R2= 0.999 7。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可看出，在10～100 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光度與釩質(zhì)量濃度之間呈線性相關(guān)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.94%～4.35%，具有較好的相關(guān)性與穩(wěn)定性。

2.3.2 檢出限

經(jīng)過(guò)對(duì)空白樣品11 次的重復(fù)測(cè)定，?b= 0.008 4，標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb為0.000 43，最小測(cè)量AL=?b＋KSb。取K = 3時(shí)，檢出限為K × Sb/S = 1.44 × 10—3μg/mL；取K = 10時(shí)為定量限，定量限為K × Sb/S = 4.78 × 10—3μg/mL（Sb為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為工作曲線斜率）。

2.3.3 加標(biāo)回收率

取海參樣品進(jìn)行超聲波輔助消化并用GFAAS測(cè)定釩含量，對(duì)6 個(gè)樣品分別加標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。加標(biāo)回收率均在94.2%～105.4%之間，表明本法符合測(cè)試要求。

表3 樣品加標(biāo)回收率結(jié)果Table3 Recoveries of vanadium from spiked samples

2.4 海參釩含量及其有機(jī)化程度分析

2.4.1 不同產(chǎn)地仿刺參的釩含量及其有機(jī)化程度分析

由于體壁是海參產(chǎn)品的主要可食部分，因此選取了中國(guó)不同產(chǎn)地冬季收獲的仿刺參，并利用UAD-GFAAS法對(duì)其體壁的釩含量進(jìn)行了測(cè)定。8 種不同產(chǎn)地仿刺參中的總釩含量、有機(jī)釩含量及有機(jī)化程度見(jiàn)表4。從總釩含量和有機(jī)釩含量來(lái)看，南北方有較大的差異，分別在0.27～1.43、0.22～1.08 μg/g之間波動(dòng)，產(chǎn)自北方的大連獐子島與煙臺(tái)蓬萊的仿刺參總釩含量最高，分別達(dá)到1.43 μg/g和1.32 μg/g，有機(jī)釩含量同樣最高，分別為1.08 μg/g和1.02 μg/g。與南方海域的仿刺參相比，北方海域的海參具有更高的釩含量，總釩量在0.91～1.43 μg/g之間，但差異不顯著。同時(shí)，各產(chǎn)地仿刺參有機(jī)化程度在60.4%～85.7%之間，產(chǎn)自浙江溫州的仿刺參有機(jī)化程度最高，達(dá)到85.7%，證明海參中釩主要以有機(jī)釩的形式存在。推測(cè)由于海參是一種底棲雜食性的海洋生物，主要以底質(zhì)中的有機(jī)質(zhì)、某些細(xì)菌和原生動(dòng)物為食，海參在攝入無(wú)機(jī)態(tài)的釩后，大多數(shù)的釩會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化成有機(jī)形式。

表4 不同產(chǎn)地仿刺參的釩含量Table4 The contents of vanadium in sea cucumber Apostichopus opus japonicus icus from different regions ns

2.4.2 不同種類海參的有機(jī)釩含量分析

鑒于釩在海參中的主要存在形式是有機(jī)釩，因此對(duì)不同種類海參中的有機(jī)釩含量進(jìn)行比較研究。墨西哥等刺參、美國(guó)肉參、加州擬刺參、南非花刺參、梅花參、革皮氏海參、北極海參、糙海參、黃乳海參、白底輻肛參、圖紋白尼參、北大西洋瓜參、長(zhǎng)尾蝶參、白肛海地瓜14 種海參的有機(jī)釩含量結(jié)果如表5所示。

由表5可見(jiàn)，海參科比刺參科、瓜參科、蝶參科、尻參科具有更高的有機(jī)釩含量，在0.8～2.56 μg/g之間，其中糙海參與圖紋白尼參釩含量最高，分別達(dá)到2.56 μg/g和2.42 μg/g，而蝶參、梅花參、海地瓜有機(jī)釩含量最低，分別只有0.18、0.35、0.55 μg/g，海參大多生活在中緯度及低緯度海域，其中中緯度產(chǎn)海參中有機(jī)釩含量相比于低緯度海域產(chǎn)的海參要高，這可能由于中緯度海域氣候及海水水質(zhì)的差異導(dǎo)致。Abdel-Moati[24]、Anan[25]等分別研究了約40 種來(lái)自卡塔爾和里海海域的魚(yú)類物種，闡明了釩含量具有類似的區(qū)域特點(diǎn)。從亞得里亞海海域不同采樣點(diǎn)收獲的貽貝，紫貽貝中也發(fā)現(xiàn)了釩含量的差異性（約0.5～7.5 μg/g）[26]。此后，Warnau等[27]發(fā)現(xiàn)，海參（Holothuria tubulosa）中的Ca、Fe等金屬濃度受到器官、季節(jié)、環(huán)境因素影響。

表5 不同種類海參的有機(jī)釩含量Table 5 The contents of vanadium in different species of Table 5 The contents of vanadium in different species of sea cucumbers bers

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)研究了超聲波輔助實(shí)現(xiàn)了海參樣品的快速消化，過(guò)程簡(jiǎn)便、快速、成本低，同時(shí)四因素三水平的正交試驗(yàn)得到了最佳的石墨爐原子吸收工作條件。當(dāng)超聲波水浴60 ℃條件下消化30 min，可以達(dá)到金屬元素的快速釋放，同時(shí)在石墨爐灰化溫度900 ℃、原子化溫度2 700 ℃、灰化時(shí)間20 s和原子化時(shí)間5 s條件下，檢出限為1.44×10－3μg/mL，并成功應(yīng)用到海參中釩含量的測(cè)定。

分析8 種我國(guó)不同產(chǎn)地的仿刺參與14 種海參中釩含量的結(jié)果表明，海參中的釩含量受品種、采樣地點(diǎn)和環(huán)境的影響，并且海參中60.4%～85.7%的釩是以有機(jī)形式存在。產(chǎn)自中國(guó)南北8 個(gè)產(chǎn)地的仿刺參總釩、有機(jī)釩含量分別在0.27～1.43、0.22～1.08 μg/g之間，南北方具有明顯的差異性，同時(shí)海參中的釩主要以有機(jī)釩的形式存在。海參中的釩含量差異可能是由于周圍的采樣點(diǎn)的地質(zhì)和水質(zhì)特征或海參體內(nèi)的累積機(jī)制差異導(dǎo)致。同時(shí)，由于海參中有機(jī)釩的存在，其存在形式、價(jià)態(tài)及降糖活性等值得深入研究。本實(shí)驗(yàn)正在調(diào)查更大的樣本庫(kù)以正確表征影響釩的生物利用度和釩在海參中的積累機(jī)制的生物和環(huán)境因素，本研究為之提供了快速有效的定量方法。

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Determination of Vanadium in Sea Cucumbers by Ultrasound-Assisted Digestion-Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry

LIU Yanjun, XU Jie, ZHOU Qingxin, XUE Yong, XUE Changhu*, WANG Jingfeng
(College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A fast method for vanadium determination by ultrasound-assisted digestion-graphite furnace atomic absorption spectrometry (UAD-GFAAS) was proposed. Using single factor and L9(34) orthogonal array designs, the best digestion conditions (30 min, 60 ℃) influencing and the best GFAAS conditions (ashing at 900 ℃ for 20 s, atomization at 2 700 ℃for 5 s) were achieved. The UAD-GFAAS method could provide complete mineralization of the samples for vanadium determination in sea cucumber with a detection limit of 1.44 × 10-3μg/mL and acceptable analytical recovery of 94.2%–105.4% for vanadium. Values of 0.27–1.43 μg/g in terms of total vanadium and 0.22–1.08 μg/g in terms of organic vanadium were obtained in sea cucumbers from different sampling sites, suggesting a significant difference between North and South coastal habitats of China. The highest vanadium content (2.56 μg/g) in Holothuria scabra was determined among fourteen species of edible sea cucumber. Total vanadium and organic vanadium contents showed significant differences among different species and different sampling sites of sea cucumbers. Moreover, most vanadium exists in an organic form. Therefore, ultrasound-assisted digestion-graphite furnace atomic absorption spectrometry is a rapid, accurate and stable method, which has a high practical value.

vanadium; sea cucumber; organic degree; ultrasound-assisted digestion and graphite furnace atomic absorption spectrometry

TS254.1

A

1002-6630（2015）04-0126-05

10.7506/spkx1002-6630-201504024

2014-05-30

國(guó)家海洋公益性科研項(xiàng)目（201105029）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201329）；長(zhǎng)江學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（IRT1188）

劉炎峻（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：fs-lauyang@hotmail.com

*通信作者：薛長(zhǎng)湖（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)化學(xué)。E-mail：xuech@ouc.edu.cn