梅毒患者血清IL－33和IL－35與梅毒細(xì)胞免疫的相關(guān)性

張勝佳田洪青李中偉鄭榮濤侯建玲李富容

·論著·

梅毒患者血清IL－33和IL－35與梅毒細(xì)胞免疫的相關(guān)性

張勝佳1田洪青2?李中偉2鄭榮濤2侯建玲2李富容2

目的: 檢測(cè)梅毒患者血清IL－33和IL－35的表達(dá)。方法: 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)梅毒患者和正常對(duì)照血清IL－33和IL－35的表達(dá)。結(jié)果: 梅毒患者血清IL－33和IL－35的表達(dá)與對(duì)照比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.638和P＝0.122)。一期梅毒、二期梅毒、潛伏梅毒間IL－33和IL－35比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.116，P＝0.132)。結(jié)論: 梅毒患者外周血清IL－33和IL－35可能與梅毒的細(xì)胞免疫無(wú)相關(guān)性。

梅毒； 細(xì)胞免疫； 白介素33； 白介素35

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，TP)引起的一種慢性性傳播疾病，幾乎可侵犯全身各個(gè)器官，產(chǎn)生多種多樣的癥狀或體征、功能障礙、組織破壞乃至死亡。梅毒患者的細(xì)胞免疫抑制－Th1/Th2反應(yīng)的失衡(Th1反應(yīng)向Th2反應(yīng)漂移)和CD4CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)高度表達(dá)是造成機(jī)體不能有效清除梅毒螺旋體和病情遷延發(fā)展的原因之一。1－3IL－33是IL－1超家族的成員，其特異性受體是ST2。IL－33/ ST2通路是Th2反應(yīng)的活化因子，誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與Th2型細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。4IL－35是IL－12家族成員，由CD4CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)產(chǎn)生，是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用所必需的細(xì)胞因子。5IL－35還可以抑制Th17的分化和IL－17的合成而Th17以及它的細(xì)胞因子IL－17在梅毒的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。6，7因此我們想通過(guò)檢測(cè)梅毒患者和正常對(duì)照組外周血中IL－33和IL－35表達(dá)水平，來(lái)探討IL－33、IL－35是否參與梅毒的細(xì)胞免疫抑制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象均為2013年4月至2014年3月就診于我院性病門診的梅毒初診患者。梅毒入選標(biāo)準(zhǔn):未經(jīng)驅(qū)梅治療；TRUST和TPPA試驗(yàn)均陽(yáng)性，或TP－PCR陽(yáng)性。對(duì)照入選標(biāo)準(zhǔn):無(wú)梅毒相關(guān)臨床表現(xiàn)；未經(jīng)驅(qū)梅治療；TRUST和TPPA試驗(yàn)均陰性；可疑患者如果行TP－PCR檢測(cè)，結(jié)果為陰性。梅毒和對(duì)照的排除標(biāo)準(zhǔn):①HIV抗體檢測(cè)陽(yáng)性；②患有自身免疫性疾病或其他感染性疾病者；③妊娠、哺乳期婦女。

入選患者180例，但由于標(biāo)本試驗(yàn)中蛋白質(zhì)降解問(wèn)題，納入統(tǒng)計(jì)的患者數(shù):IL－33為153例、IL－35為133例。IL－33病例組:男71例，女82例；年齡16～86歲(平均32.4歲)；一期梅毒15例，二期梅毒32例，早期潛伏梅毒(病期在2年以內(nèi))64例，晚期潛伏梅毒(病期大于2年)42例；有癥狀梅毒組包括一期和二期梅毒，無(wú)癥狀梅毒組包括早期和晚期潛伏梅毒。IL－35病例組:男65例，女68例；年齡15～86歲(平均32.7歲)；一期梅毒12例，二期梅毒26例，早

期潛伏梅毒59例，晚期潛伏梅毒36例。對(duì)照組入選180例，由于蛋白質(zhì)降解的問(wèn)題最終納入統(tǒng)計(jì)的例數(shù):IL－33為162例、IL－35為156例。對(duì)照組IL－33:男93例、女69例，年齡17～69歲(平均33.2歲)；對(duì)照組IL－35:男85例，女71例，年齡18～69歲(平均33.7歲)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要儀器和試劑 IL－33、IL－35 ELISA試劑盒(上海嚴(yán)謹(jǐn)生物科技有限公司)；酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；微孔振蕩器；電熱恒溫培養(yǎng)箱；TRUST和TPPA試劑盒。

1.2.2 標(biāo)本采集 抽取患者和對(duì)照組靜脈血2 mL，收集于無(wú)菌干燥試劑管中，靜置、分離血清后置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 TRUST、TPPA、HIV檢測(cè)，操作均嚴(yán)格按照操作規(guī)則進(jìn)行。

1.2.4 IL－33、IL－35水平檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA方法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作(標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、測(cè)定)。在450 nm波長(zhǎng)按順序測(cè)量出各標(biāo)本的吸光度(OD值)。用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)(P50)、百分位數(shù)(P25，P75)描述；兩組獨(dú)立非正態(tài)分布資料比較采用Mann－Whitney檢驗(yàn)，3組及以上非正態(tài)分布資料比較采用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL－33和IL－35在對(duì)照組和病例組的檢測(cè)結(jié)果(表1)，Mann－Whitney檢驗(yàn)結(jié)果顯示 IL－33對(duì)照組(162例)和病例組(153例)的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，IL－35對(duì)照組(156例)和病例組(133例)的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 IL－33、IL－35在對(duì)照組、一期梅毒組、二期梅毒組、早期潛伏梅毒組、晚期潛伏梅毒組的檢測(cè)結(jié)果(表2)，Kruskal－Wallis檢驗(yàn)顯示5組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 IL－33、IL－35在對(duì)照組、有癥狀梅毒組和無(wú)癥狀梅毒組的檢測(cè)結(jié)果(表3)，Kruskal－Wallis檢驗(yàn)結(jié)果顯示，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 IL－33和IL－35在對(duì)照組與病例組的檢測(cè)結(jié)果

表2 IL－33和IL－35在各期梅毒的檢測(cè)結(jié)果

表3 IL－33和IL－35在有/無(wú)癥狀梅毒的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

IL－33是2005年發(fā)現(xiàn)的白介素1的家族新成員，其基因序列和結(jié)構(gòu)同IL－1β、IL－18相似。人IL－33的基因定位于9號(hào)染色體(9p24.1)，IL－33以前體蛋白的形式分泌，經(jīng)一系列加工剪切形成具有活性的成熟蛋白，IL－33發(fā)揮作用主要是通過(guò)特異性受體－ST2，ST2在1989年被發(fā)現(xiàn)，其基因定位于人2號(hào)染色體(2q12)，Th2細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)。IL－33是Th2細(xì)胞的活化因子，參與炎癥和免疫反應(yīng)的發(fā)生。IL－33/ST2通路在炎癥性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病中有著重要作用。8－11隨著人們對(duì)IL－33研究的深入，人們對(duì)IL－33/ST2通路在感染性疾病中發(fā)揮的作用也越來(lái)越感興趣。梅毒的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，細(xì)胞免疫機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，細(xì)胞免疫異常是梅毒發(fā)病和病程遷延的主要原因之一。Th1/Th2反應(yīng)的失衡、抑制性T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、CD4＋和CD8＋T細(xì)胞、Th17和Th22細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子是最近幾年梅毒發(fā)病機(jī)制研究的主要領(lǐng)域。尤其是1992年Fitzger

ard學(xué)者提出了梅毒發(fā)病機(jī)制中Th1/Th2反應(yīng)的失衡學(xué)說(shuō):隨著梅毒病程的遷延，梅毒的發(fā)病以Th1型反應(yīng)介導(dǎo)為主逐漸向Th2型反應(yīng)介導(dǎo)為主的反應(yīng)遷移轉(zhuǎn)變，理論上梅毒螺旋體的清除應(yīng)以Th1細(xì)胞免疫為主，而向Th2方向的漂移則抑制了機(jī)體的細(xì)胞免疫，造成梅毒病程的遷延。1

IL－33/ST2通路可誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與Th2介導(dǎo)的反應(yīng)。鑒于梅毒細(xì)胞免疫機(jī)制和IL－33、Th2型反應(yīng)有著密切的關(guān)聯(lián)，我們檢測(cè)了梅毒患者和正常對(duì)照的血清IL－33的表達(dá)水平，探索IL－33是否與梅毒的細(xì)胞內(nèi)免疫機(jī)制有關(guān)，盡管研究結(jié)果顯示梅毒患者IL－33、IL－35的血清濃度低于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各期梅毒之間、有癥狀組與無(wú)癥狀組之間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

IL－35是新近發(fā)現(xiàn)的一種新型抑制性細(xì)胞因子，屬于IL－12家族成員，是由 EB病毒誘導(dǎo)基因(EBI13)和IL－12的p35亞基組成的異二聚體，定位于人第17號(hào)染色體，IL－35由Treg細(xì)胞特異性產(chǎn)生，是Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制作用所必須的細(xì)胞因子，能有效地抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增值、Th17的分化以及IL－17的合成，有望成為調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞活性的新型靶分子。IL－35在自身免疫性疾病、調(diào)節(jié)病原微生物引起的免疫應(yīng)答、腫瘤抑制、誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受形成等方面發(fā)揮著重要作用。13－15梅毒患者Treg細(xì)胞明顯增高，抑制細(xì)胞免疫功能，削弱了機(jī)體對(duì)梅毒螺旋體的清除和殺傷。16IL－35是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用的關(guān)鍵因子。此外，IL－35還可以抑制Th17反應(yīng)和IL－17的合成，而Th17以及IL－17在梅毒外周血中的高度表達(dá)，在梅毒發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。7因此我們檢測(cè)了梅毒與對(duì)照組的血清IL－35的表達(dá)，但是同樣無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各期梅毒之間、有癥狀組與無(wú)癥狀組之間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

出現(xiàn)以上結(jié)果可能的原因如下:1.研究例數(shù)少，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本或者進(jìn)一步分層研究，可能會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果。由于病例所限，本研究未納入晚期有癥狀梅毒，可能也對(duì)結(jié)果造成一定影響；2.IL－33和IL－35未參與梅毒的細(xì)胞免疫抑制。IL－33未參與Th1/Th2失衡過(guò)程，向Th2方向的漂移存在其他的機(jī)制。IL－35作為Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的關(guān)鍵性細(xì)胞因子未參與梅毒細(xì)胞免疫功能抑制過(guò)程，高度表達(dá)的Treg細(xì)胞造成的梅毒細(xì)胞免疫抑制并未通過(guò)IL－35產(chǎn)生作用，可能通過(guò)其他細(xì)胞因子或機(jī)制產(chǎn)生作用。

1 Fitzgerald TJ.The Thl/Th2－like switch in syphilitic infection:is itdetrimental.Infect Immun，1992，60(9):3475－3479.

2 Fan YM，Zou XH，Wu ZH，et al.Analysis of Th1/Th2 and Tc1/Tc2 balance from peripheral blood in patients with secondary early syphilis.Chin J Sex Transm Infect，2004，4(2):72－77.

3孫澍彬，歐健梅，莊慈妹，等.CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與IL－17在梅毒血清固定患者外周血中的表達(dá)及意義.皮膚性病診療學(xué)雜志，2012，19(1):1674－8486.

4 Komai－Koma M，Xu D，Li Y，et al.IL－33 is a chemoattractant for human Th2 cells.Eur J Immunol，2007，37(10):2779－2786.

5 Niedbala W，Wei XQ，Cai B，et al.IL－35 is a novel cytokine with therapeutic effects againstcollagen－induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells. Eur J Immunol，2007，37(11):3021－3029.

6 Weaver CT，Harrington LE，Mangan PR，et al.Th17:an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties.Immunity，2006，24(6):677－688.

7 Zhu A，Han H，Zhao H，et al.Increased frequencies of Th17 and Th22 cells in the peripheral blood of patients with secondary syphilis.FEMS Immunol Med Microbiol，2012，66(3):299－306.

8 Palmer G，Talabot－Ayer D，Lamacchia C，et al.Inhibition of interleukin－33 signaling attenuates the severity of experimental arthritis.Arthritis Rheum，2009，60(3):738－749.

9 Carrriere V，Roussel L，Ortega N，et al.IL－33，the IL－1－like cytokine ligand for ST2 receptor，is a chromatin－associated nuclear factor in vivo.Proc Natl ACad Sci USA，2007，104(1):282－287.

10 Schmitz J，Owyang A，Oldham E，et al.IL－33，an interleukin 1－like cytokine that signals via the IL－1 receptor－related protein ST2 and induces T helper type 2－associated cytokines.Immunity，2005，23(5):479－490.11 Milovanovic M，Volarevic V，Radosavljevic G，et al.IL－33/ ST2 axis in inflammation and immnnopathology.Immnnol Res，2012，52(1－2):89－99.

12 Chaturvedi V，Collison LW，Guy CS，et al.Cutting edge:Human regulatory T cell require IL－35 to mediate suppression and infectious tolerance.J Immunol，2011，186(12):6661－6666.

13 Yang J，Yang M，Htut TM，et al.Epstein－Barr virus－induced gene 3 negatively regulates IL－17，IL－22 and ROR gammat. Eur J Immunol，2008，38(5):1204－1214.

14 Ning－Wei Z.Interleukin(IL)－35 is rasing our expectations. Rev Med Chil，2010，138(6):758－766.

15 Taylor AL，Llewelyn MJ.Superantigen－induced proliferationof human CD4＋CD25－T cells is followed by a switch to a functional regulatory phenotype.J Immunol，2010，185(11):6591－6598.

(收稿:2014－12－29 修回:2015－01－25)

The relevance of serum levels of IL－33 and IL－35 with profeta’s immunity in the patients with syphilis

ZHANG Sheng-jia，TIAN Hong-qing，LI Zhong-wei，et al.School of Medical and Life Science，Ji’nan University，250062

Objective:To detect the levels of IL－33 and IL－35 in the patients with syphilis.Methods: The levels of IL－33 and IL－35 in the patients and healthy controls were detected with ELISA.Results:There was no significant difference in the levels of IL－33 and IL－35 between the patients and controls(P＝0.63 and P＝0.122).There were no significant difference in the levels of IL－33 and IL－35 among primary syphilis，secondary syphilis and latent syphilis.Conclusion:IL－33 and IL－35 may not correlate with the cellular immunity in the patients with syphylis.

syphilis；cellular immunity interleukin；IL－33；IL－35

山東省自然科學(xué)基金(編號(hào):ZR2013HM076)

1濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院2山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022

?通信作者