丹參酮聯(lián)合氧化苦參堿干預(yù)銀屑病模型的實(shí)驗(yàn)研究

王東英 彭 巍劉 劍 胡 成 陳意蕾

·論著·

丹參酮聯(lián)合氧化苦參堿干預(yù)銀屑病模型的實(shí)驗(yàn)研究

王東英 彭 巍?劉 劍 胡 成 陳意蕾

目的: 明確丹參酮聯(lián)合氧化苦參堿對(duì)銀屑病模型細(xì)胞增殖、顆粒層形成及小鼠陰道上皮有絲分裂的影響。方法: 體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞、構(gòu)建小鼠尾鱗片形成模型和小鼠陰道上皮細(xì)胞過(guò)度增殖模型，構(gòu)建成功后分別分組給予丹參酮、氧化苦參堿及丹參酮與氧化苦參堿聯(lián)合的處理。結(jié)果: 丹參酮，氧化苦參堿及聯(lián)合用藥對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖均具有濃度依賴性抑制作用且丹參酮和氧化苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)；丹參酮、氧化苦參堿及聯(lián)合用藥均可促進(jìn)小鼠尾部皮膚顆粒層的形成，可抑制小鼠陰道上皮有絲分裂，聯(lián)合用藥組作用最強(qiáng)。結(jié)論: 丹參酮和氧化苦參堿聯(lián)合應(yīng)用具有抑制HaCaT細(xì)胞增殖和陰道上皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)顆粒層形成的作用。

丹參酮； 氧化苦參堿； 銀屑病

HaCaT細(xì)胞是正常突變的永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株，是目前研究銀屑病最常用的細(xì)胞模型之一。HaCaT細(xì)胞的生物學(xué)特性與原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞類似，但操作更為簡(jiǎn)單。1鼠尾鱗片表皮天然缺乏顆粒層而呈現(xiàn)出角化不全的特征，可模擬銀屑病角化不全的特點(diǎn)，利用此模型可評(píng)價(jià)藥物促進(jìn)顆粒層形成的作用。小鼠陰道上皮細(xì)胞可因雌激素刺激而發(fā)生周期性增殖活躍、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換加快等變化，若藥物能抑制細(xì)胞過(guò)度增生，則認(rèn)為該受試物對(duì)有絲分裂有抑制作用，可用于銀屑病的治療。這兩種模型與誘發(fā)性模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、異體移植模型等相比操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，是國(guó)內(nèi)研究銀屑病治療藥物最常用的動(dòng)物模型。2

丹參酮(Tanshinone)亦稱總丹參酮，是從中藥丹參提取的一類脂溶性菲醌化合物，具有抗菌、消炎、活血化瘀、促進(jìn)傷口愈合等多方面作用。商干偉等3，4研究發(fā)現(xiàn)丹參酮對(duì)斑塊型和點(diǎn)滴型銀屑病有較好的治療效果，王均5研究發(fā)現(xiàn)丹參酮治療尋常型銀屑病的臨床療效高且無(wú)明顯不良反應(yīng)。氧化苦參堿(Oxymatrine，OMT)系豆科槐屬植物苦參等所含生物堿，具有抗炎、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明該藥具有抑制細(xì)胞有絲分裂和促進(jìn)顆粒層形成作用，所以應(yīng)用在銀屑病治療中可以抑制表皮細(xì)胞增生過(guò)快和促進(jìn)表皮顆粒層形成。6

目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)丹參酮與氧化苦參堿聯(lián)合治療銀屑病的報(bào)道，但丹參和苦參在許多治療銀屑病的中藥制劑如克銀方、涼血消銀湯等之中較為常見(jiàn)。7，8本課題旨在觀察丹參酮與氧化苦參堿聯(lián)合應(yīng)用對(duì)實(shí)驗(yàn)性銀屑病模型的作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料

ICR小鼠，18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào):0186652，0208265。飼養(yǎng)條件:室溫22.28±0.71℃，濕度(53.43±3.69)%；光照明暗12 h/12 h。飼料購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(軍) 2007－0005。飲用水為自來(lái)水過(guò)濾，自由飲用。人永生角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。復(fù)方地蒽酚軟膏(20 g/支，地蒽酚1%，水楊酸3%，批號(hào)140220)購(gòu)自武漢中聯(lián)集團(tuán)四藥藥業(yè)有限公司。丹參酮軟膏(2%)、氧化苦參堿軟膏(4%)及復(fù)方丹參酮氧化苦參堿軟膏(丹參酮2%，氧化苦參堿4%)由本院藥劑科配制，批號(hào):T20140303、O20140303、C20140303。封閉式全自動(dòng)組織脫水機(jī)(ASP300，Leica，德國(guó))；分體式組織包埋機(jī)(EG1140，Leica，德國(guó))；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2145，Leica，德國(guó))；倒置熒光顯微鏡(IX71，Olympus，日本)。

2 方法

2.1 HaCaT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) HaCaT細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔200 μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后給藥。丹參濃度2、4、8、16、32、64 μg/mL、氧化苦參堿濃度4、8、16、32、64、128 μg/mL、聯(lián)合用藥組濃度2.5、5、10、20、40、 80 μg/mL(其中丹參酮與氧化苦參堿質(zhì)量比為1∶2)，另設(shè)空白對(duì)照組。給藥后繼續(xù)孵育24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入二甲亞砜150 μL，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)量各孔的吸光度值。每濃度設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，平行測(cè)定3次取平均值。計(jì)算增殖抑制率及IC50，聯(lián)合用藥組求得IC50后，計(jì)算其中丹參酮與氧化苦參堿含量，采用等效應(yīng)曲線圖觀察丹參酮和氧化苦參堿是否具有協(xié)同效應(yīng)。

2.2 小鼠尾鱗片顆粒層形成實(shí)驗(yàn) ICR小鼠50只，按體重隨機(jī)分為5組。模型對(duì)照組尾部涂抹凡士林，陽(yáng)性對(duì)照涂抹復(fù)方地蒽酚軟膏，給藥組分別給予丹參酮軟膏、氧化苦參堿軟膏及復(fù)方丹參酮氧化苦參堿軟膏。沿小鼠背側(cè)尾根2～4 cm處涂藥，50 mg/次·d，連續(xù)給藥7 d。末次給藥24 h后CO2麻醉處死小鼠，取給藥處皮膚，10%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切厚約5 μm片，蘇木素－伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡觀察鼠尾部皮膚角化層、顆粒層等變化，計(jì)數(shù)各實(shí)驗(yàn)組尾鱗片中有顆粒層形成的鱗片數(shù)。

2.3 小鼠陰道上皮增殖實(shí)驗(yàn) ICR小鼠60只，按體重隨機(jī)分為6組，除空白對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射己烯雌酚0.2 mg/只，每日給藥1次，給藥3 d構(gòu)建小鼠陰道上皮有絲分裂模型。固定模型小鼠，取預(yù)先吸有藥物的鈍性管，小心插入陰道2～3 mm，灌注相應(yīng)劑量的藥物，動(dòng)作要輕柔，不能對(duì)陰道黏膜造成機(jī)械損傷?？瞻讓?duì)照組不給藥，模型對(duì)照組給予凡士林，陽(yáng)性對(duì)照給予復(fù)方地蒽酚軟膏，給藥組分別給予丹參酮軟膏、氧化苦參堿軟膏及復(fù)方丹參酮氧化苦參堿軟膏。每日給藥1次，給藥7 d，末次給藥1 h后，各組小鼠腹腔注射秋水仙堿2 mg/kg，使細(xì)胞有絲分裂停滯于有絲分裂中期。注射秋水仙堿4 h后麻醉處死動(dòng)物。取陰道10%中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，每個(gè)標(biāo)本切片2張，1張進(jìn)行HE染色，觀察有絲分裂情況并計(jì)算有絲分裂指數(shù)(每100個(gè)基底細(xì)胞有絲分裂數(shù))。另一張進(jìn)行免疫組化染色，觀察增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的陽(yáng)性表達(dá)率。陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，主要位于細(xì)胞核，偶見(jiàn)胞漿。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，每組觀察50個(gè)高倍視野。每個(gè)視野觀察2個(gè)指標(biāo):以標(biāo)準(zhǔn)＜20%為1；20%～50%為2；＞50%為3，反應(yīng)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的比例；以在陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞中多數(shù)細(xì)胞核淺著色為1；多數(shù)深著色邊界清楚為2。以上兩項(xiàng)相加等于2為(＋)；等于3為(＋＋)；≥4為(＋＋＋)，陽(yáng)性反應(yīng)著色深度。9

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，記數(shù)數(shù)據(jù)組間比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 丹參酮聯(lián)合氧化苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響 丹參酮2～64 μg/mL，氧化苦參堿4～128 μg/mL及聯(lián)合用藥2.5～80 μg/mL對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖均具有濃度依賴性抑制作用，其IC50(95%置信區(qū)間)分別為47.2(36.0～69.3)μg/mL，124.4(84.3～314.3) μg/mL，24.2(7.1～43.1)μg/mL。其中聯(lián)合用藥組中丹參酮和氧化苦參堿含量分別為8.1(2.4～14.4)μg/ mL，16.1(4.7～28.7)μg/mL。等效應(yīng)曲線顯示，丹參酮和氧化苦參堿在所設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi)對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)，見(jiàn)圖1。

圖1 等效應(yīng)曲線圖

以丹參酮的IC50(95%置信區(qū)間)為橫軸，氧化苦參堿的IC50(95%置信區(qū)間)為縱軸作圖，連接兩坐標(biāo)軸上相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)即為等效應(yīng)曲線，聯(lián)合用藥組IC50(95%置信區(qū)間)以其中丹參酮的含量為橫坐標(biāo)，氧化苦參堿的含量為縱坐標(biāo)，確定其在等效應(yīng)曲線圖上所處位置，如圖所示處于等效應(yīng)曲線下方，即丹參酮和氧化苦參堿具有協(xié)同作用。

3.2 丹參酮聯(lián)合氧化苦參堿對(duì)小鼠尾鱗片顆粒層形成的影響 空白對(duì)照組表皮偶見(jiàn)個(gè)別鱗片有顆粒層形成，陽(yáng)性對(duì)照組鱗片顆粒層形成明顯增多。給藥組表皮可見(jiàn)較多有顆粒層形成的鱗片，見(jiàn)表1，圖2。

3.3 丹參酮聯(lián)合氧化苦參堿對(duì)小鼠陰道上皮增殖的影響 空白對(duì)照組小鼠陰道上皮正常，可見(jiàn)少量有絲分裂細(xì)胞，PCNA陽(yáng)性率低。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠陰道上皮角化層明顯，有絲分裂指數(shù)顯著增高(P＜0.01)，PCNA陽(yáng)性率明顯增高(P＜0.01)。給藥各組均可抑制小鼠陰道上皮有絲分裂及PCNA的表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)且復(fù)方丹參酮氧化苦參堿軟膏組效果優(yōu)于丹參酮軟膏組和氧化苦參堿軟膏組，見(jiàn)表2，圖3。

表1 各組對(duì)小鼠尾部鱗片顆粒層的影響

圖2 各組對(duì)小鼠尾鱗片顆粒層形成的影響(HE，×200)

表2 各組對(duì)小鼠陰道上皮有絲分裂的影響

圖3 各組對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響(HE，×200)

4 討論

銀屑病是一種以表皮過(guò)度增殖、真皮慢性炎癥、角化不全為主要特征的易發(fā)性炎性皮膚病，具有病程長(zhǎng)、頑固難愈和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的身心健康及生活質(zhì)量。10銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一藥物的局部應(yīng)用往往難以達(dá)到較好的治療效果，因此在實(shí)際治療中常聯(lián)合用藥，在不明顯增加副作用的同時(shí)可達(dá)到較好的治療效果。11研究表明免疫系統(tǒng)參與銀屑病的發(fā)生和發(fā)展，免疫因子激活T細(xì)胞釋放白介素、細(xì)胞因子、干擾素等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)棘層細(xì)胞增厚，表皮細(xì)胞過(guò)度增殖。10因此抑制表皮細(xì)胞的異常增生是治療銀屑病的關(guān)鍵。

中醫(yī)將銀屑病分為血燥型、血淤型等。認(rèn)為治療宜采用滋陰潤(rùn)燥、養(yǎng)血化淤、解毒退疹的治療原則。丹參具有活血化瘀改善皮膚血液循環(huán)的作用，苦參則有祛風(fēng)潤(rùn)膚止癢等作用，因此丹參和苦參常是治療銀屑病的中藥之一。除在多味藥材的復(fù)方中共同使用，單純苦參和丹參制劑復(fù)合應(yīng)用亦有許多研究，李國(guó)軍等12采用苦參素聯(lián)合丹參注射液治療慢性乙型肝炎，取得了良好的效果。丹參酮和氧化苦參堿單獨(dú)應(yīng)用對(duì)于銀屑病模型及患者均具有良好療效，施惠娟等13發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可抑制雌激素周期小鼠陰道上皮細(xì)胞的增殖，該作用可能與其降低表皮細(xì)胞PCNA表達(dá)水平，促進(jìn)表皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。張玉杰等14觀察了丹參酮膠囊對(duì)進(jìn)展進(jìn)期銀屑病的療效，認(rèn)為丹參酮膠囊是一種療效優(yōu)越、安全性高的銀屑病治療藥物。以上研究為丹參酮和氧化苦參堿聯(lián)合應(yīng)用于銀屑病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

本研究采用HaCaT細(xì)胞增殖模型、小鼠尾鱗片模型和小鼠陰道上皮細(xì)胞模型，比較了丹參酮、氧化苦參堿及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)以上3種模型的影響，結(jié)果顯示，丹參酮和氧化苦參堿單獨(dú)應(yīng)用均可抑制HaCaT細(xì)胞增殖，促進(jìn)小鼠尾部皮膚顆粒層形成，抑制己烯雌酚引起的小鼠陰道上皮細(xì)胞異常增殖，而復(fù)方丹參酮氧化苦參堿組對(duì)3種模型的作用均優(yōu)于丹參酮和氧化苦參堿單獨(dú)應(yīng)用，且在HaCaT細(xì)胞增殖模型上，二者聯(lián)合應(yīng)用呈現(xiàn)明顯的協(xié)同作用，證明丹參酮和氧化苦參堿聯(lián)合應(yīng)用于銀屑病治療具有較好的效果，值得進(jìn)一步研究。

1陶春蓉，黃國(guó)軍，艾儒棣，等.白疕方及其組成藥物提取液對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響.中國(guó)中醫(yī)急癥，2012，21(2):230－231.

2袁媛，朱鍵平，陳系古.銀屑病動(dòng)物模型.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，16(1):70－73.

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6鄭小景.窄譜中波紫外線聯(lián)合苦參素膠囊治療尋常型銀屑病療效觀察.醫(yī)藥前沿，2013，20:213.

7劉靖，查旭山.涼血消銀湯治療進(jìn)行期尋常型銀屑病(血熱證)32例療效觀察.新中醫(yī)，2006，38(8):28－29.

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(收稿:2014－08－20)

The effects of Tanshinone combined with Oxymatrine on the psoriasis model

WANG Dong-ying，PENG Wei，LIU Jian，et al.The 92nd Hospital of PLA，F(xiàn)ujian，353000

Objective:To determine the effects of Tanshinone combined with Oxymatrine on the proliferation of HaCaT cells，stratum granulosum formation and mitosis of mouse vaginal epithelia.Methods:HaCaT cells were cultured in vitro and the tail scale formation mouse model and vaginal epithelial cells excessive proliferation mouse model were constructed.The HaCaT cells and the mice in the two models were treated with Tanshinone，Oxymatrine and Tanshinone combined with Oxymatrine.Results:The proliferation of HaCaT cells was inhibited after treated with Tanshinone，Oxymatrine and Tanshinone combined with Oxymatrine in a concentration－dependent manner.Oxymatrine and Tanshinone cooperated mutually in the process of inhibiting the proliferation of HaCaT cells.The granular cells in the flake of the mouse’s tail were increased and the mitosis of mouse vaginal epithelia was inhibited after treated with Tanshinone，Oxymatrine and Tanshinone combined with Oxymatrine.Conclusion:Tanshinone combined with Oxymatrine inhibite the HaCaT cells proliferation and mitosis of mouse vaginal epithelia and promote the formation of stratum granulosum.

Tanshinone；Oxymatrine；psoriasis

中國(guó)人民解放軍第九二醫(yī)院，福建南平，353000

?通信作者