高效液相色譜法測(cè)定還原型谷胱甘肽鈉的含量

宗春燕，朱 娜，蘇學(xué)軍

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

還原型谷胱甘肽鈉商品名為松泰斯，化學(xué)名稱為N-（N-L-谷氨酰基-L-半胱氨?；└拾彼徕c鹽，白色結(jié)晶性粉末，具有輕微的特征氣味。谷胱甘肽制劑可用于酒精中毒或某些藥物中毒的治療，亦具有抗過(guò)敏、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、抗癌、抗輻射及輔助化療等功效，因而在醫(yī)藥工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[1，2]。另外，還原型谷胱甘肽鈉在食品中的應(yīng)用也令人矚目[3]，如添加到乳制品中有相當(dāng)于維生素C的功效，可防止水果褐變，還可用作食品風(fēng)味劑，是重要的食品功能因子。

谷胱甘肽鈉的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法、發(fā)酵法和溶劑提取法[3]。目前，化學(xué)合成法和提取法已經(jīng)工業(yè)化，酶轉(zhuǎn)化法正在進(jìn)行廣泛研究。由于國(guó)內(nèi)谷胱甘肽鈉的研究起步較晚，對(duì)還原型谷胱甘肽鈉的分離分析一直是研究的熱點(diǎn)[4，5]。文獻(xiàn)報(bào)道采用的紫外分光光度法測(cè)定谷胱甘肽鈉的含量，準(zhǔn)確度不高，且干擾嚴(yán)重[6]。毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析法雖可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，精密度及準(zhǔn)確度較高，但對(duì)操作要求較高[7]。本文采用高效液相色譜儀附紫外檢測(cè)器，以磷酸二氫鈉鹽溶液為流動(dòng)相，在210nm波長(zhǎng)下測(cè)定還原型谷胱甘肽鈉的含量，能準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中的主要成分，適用于注射用還原型谷胱甘肽鈉制劑含量的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀，配有紫外檢測(cè)器及數(shù)據(jù)處理軟件，Waters公司；Sartorius電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；PS-30A超聲波清洗器，東莞潔康超聲波設(shè)備有限公司。二水合磷酸二氫鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、磷酸（色譜純，購(gòu)自MERCK公司）、谷胱甘肽對(duì)照品（純度≥99.0%，自制）；二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Synergi4u Hydro-RP 80A 250×4.60mm；流動(dòng)相：稱取二水合磷酸二氫鈉3.90g，溶解到500mL二次蒸餾水中，用85%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8，加二次蒸餾水稀釋到1000mL，過(guò)濾，經(jīng)超聲波清洗器脫氣冷卻后即得。檢測(cè)波長(zhǎng)選擇210nm，柱溫為30℃，流速為1.5 mL/min；進(jìn)樣體積 20μL。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取谷胱甘肽鈉50.0mg，置于100mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度并搖勻備用。因還原型谷胱甘肽鈉不穩(wěn)定，受溫度和光線影響后極易氧化成氧化型谷胱甘肽鈉，因而本品應(yīng)臨用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取還原型谷胱甘肽鈉樣品50.0mg，加流動(dòng)相配制成每1mL含還原型谷胱甘肽鈉0.5mg的溶液，搖勻后備用。

1.3.3 樣品的測(cè)定

分別取已制備好的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液20μL，在相同色譜條件下待基線穩(wěn)定后，連續(xù)數(shù)針進(jìn)樣，調(diào)節(jié)好檢測(cè)靈敏度，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。根據(jù)樣品峰的峰面積，按下式公式計(jì)算出樣品中谷胱甘肽鈉的含量。

樣品中還原型谷胱甘肽鈉的含量：

式中：A—對(duì)照品溶液中還原型谷胱甘肽鈉的峰面積；A＇—樣品溶液中還原型谷胱甘肽鈉的峰面積；m1—還原型谷胱甘肽鈉對(duì)照品的質(zhì)量，mg；m2—還原型谷胱甘肽鈉樣品的質(zhì)量，mg；χs—對(duì)照品中還原型谷胱甘肽鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇及系統(tǒng)適用性色譜柱

2.1.1 色譜條件的選擇

將配制好的對(duì)照品溶液，利用可變波長(zhǎng)檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn),還原型谷胱甘肽鈉在210m處有最大吸收值，故選擇210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，與文獻(xiàn)一致[5]。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

通過(guò)選用磷酸二氫鈉和乙腈的混合溶液及磷酸二氫鈉鹽溶液進(jìn)行了多次比對(duì)試驗(yàn)，結(jié)果表明,采用磷酸二氫鈉鹽溶液的檢測(cè)靈敏度可滿足檢測(cè)要求，且乙腈混合液有毒，成本高。對(duì)鹽溶液的濃度配比進(jìn)行了考查，發(fā)現(xiàn)濃度為0.0325mol/L時(shí)保留時(shí)間適當(dāng)且峰形對(duì)稱完整，故最終選定以磷酸二氫鈉和水的鹽溶液作為流動(dòng)相。

2.1.3 流速的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流速對(duì)還原型谷胱甘肽鈉的分離有一定影響，當(dāng)流速增大時(shí)，色譜峰變窄，分離度變??；當(dāng)流速減小時(shí)，色譜峰變寬，分離度變大。考慮到峰寬和分離度的要求，合適的流速選為1.5mL/min。

2.1.4 流動(dòng)相pH值的選擇

考查不同pH值的流動(dòng)相對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果顯示，pH值的變化會(huì)引起谷胱甘肽鈉峰面積的變化，pH值在2.8～3.0之間，谷胱甘肽鈉的吸收程度高，靈敏度也比較高，最終選擇流動(dòng)相的pH值為2.8。

2.1.5 系統(tǒng)適用性

系統(tǒng)適用性色譜柱的理論塔板數(shù)不低于3000，對(duì)照品色譜圖中色譜峰的分離度符合要求。

2.1.6 線性關(guān)系的確定

將配制的對(duì)照樣按5個(gè)不同濃度梯度進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜分析。以谷胱甘肽鈉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=40.25x+53.84，相關(guān)系數(shù)為R=0.9998。

2.2 專屬性試驗(yàn)

取上述選定的色譜條件，將配制好的谷胱甘肽鈉對(duì)照品溶液、還原型谷胱甘肽鈉試樣溶液以及用流動(dòng)相作為稀釋液的空白溶液，進(jìn)樣，記錄圖譜。

實(shí)驗(yàn)之前需進(jìn)一針空白，保證流動(dòng)相無(wú)污染，無(wú)其它雜質(zhì)，以防止影響樣品含量的計(jì)算，對(duì)照品圖譜如圖1所示，樣品圖譜如圖2所示。

2.3 精密度試驗(yàn)

取還原型谷胱甘肽鈉對(duì)照品溶液一份，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，結(jié)果如表1所示，RSD=0.03%。同樣條件下，再測(cè)定兩份樣品，RSD均小于1.00%。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 含量測(cè)定

平行取供試品2批，一式兩份，加入流動(dòng)相配制成每1mL含還原型谷胱甘肽鈉0.5mg的溶液，取適量注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，該法的準(zhǔn)確度良好。

表2 供試品含量測(cè)定結(jié)果

還原型谷胱甘肽鈉含量的企業(yè)指標(biāo)含量大于或等于90.0%，因此測(cè)定兩批供試品的還原型谷胱甘肽鈉的含量符合要求，為合格品。

3 結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于還原型谷胱甘肽鈉含量的高效液相色譜法分析報(bào)道相對(duì)較少，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)探索的分析方法，其精密度和準(zhǔn)確度較高，峰分離度表現(xiàn)良好，可用于還原型谷胱甘肽鈉制劑含量的測(cè)定，為企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了檢測(cè)依據(jù)。

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