復(fù)合氨基酸制劑和8周遞增負(fù)荷有氧運動對大鼠腦組織的保護作用

通訊作者，Email：hehong6819@126.com，姚水玲3，胡文忠1，林正豪1，劉龍成1，范曉星1（1.湖南師范大學(xué)體育學(xué)院，中國 長沙410012;2.體適能與運動康復(fù)湖南省重點實驗室，中國 長沙410012;

3.湖南高爾夫旅游職業(yè)學(xué)院，中國 常德415900）

摘要通過大鼠遞增負(fù)荷有氧運動訓(xùn)練模型，并聯(lián)合給予或分別給予?；撬岷椭ф湴被嶂苿?，以抗羰基應(yīng)激防御體系為研究視角，探討含有氨基生物活性小分子的復(fù)合氨基酸制劑對大鼠腦組織的保護作用.8周遞增負(fù)荷有氧運動聯(lián)合補充復(fù)合氨基酸制劑能顯著降低羰基應(yīng)激損傷，且效果明顯優(yōu)于單獨補充牛磺酸或支鏈氨基酸.

關(guān)鍵詞有氧運動;?；撬?支鏈氨基酸;復(fù)合氨基酸;羰基應(yīng)激

中圖分類號R872.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號10002537（2015）06002706

Protection of Composite Amino Acid and Eight Weeks

Progressive Loads Aerobic Exercise on Rats Brain Tissue

HE Hong1， 2*， YAO Shuiling3， HU Wenzhong1， LIN Zhenghao1， LIU Longcheng1， FAN Xiaoxing1

（1. College of Physical Education， Hunan Normal University， Changsha 410012， China;

2.Key Laboratory of Physical Fitness and Exercise Rehabilitation of Hunan Province， Changsha 410012， China;

3.Hunan Golf and Tourism College， Changde 415900， China）

AbstractThrough progressive loads aerobic exercise training rat model， from the perspective of anticarbonyl stress defense system， the study focused on the protective effect of exhausted rats which administered in combination before exercise and/or given taurine and branchedchain amino acid formulations containing composite amino acids with bioactive small molecules on brain tissue in rats. 8week progressive loads aerobic exercise on treadmill with supplement composite amino acid significantly decreased the damages of carbonyl stress and exhibited better performance than exclusive use of taurine or branchedchain amino acids.

Key wordsaerobic exercise; taurine; branchedchain amino acid; composite amino acid; carbonyl stress

眾所周知，氨基酸常被認(rèn)為是能量物質(zhì)，而支鏈氨基酸作為必需氨基酸，不僅是合成機體蛋白質(zhì)的必需成分，而且還具有顯著的抗疲勞作用[12];而?；撬嵬ㄟ^抗氧化、維持膜穩(wěn)定、調(diào)節(jié)滲透平衡等達(dá)到抗運動性疲勞的目的[37].有研究表明以L精氨酸為主要成分的氨基酸制劑對提高成績和改善訓(xùn)練時運動員的身體狀況具有明顯作用[8]，但其對機體的抗疲勞和保護作用機制尚不清楚.運動引起的心理疲勞是當(dāng)前運動醫(yī)學(xué)的研究熱點之一，根據(jù)羰基毒化理論，尋求安全有效的抗氧化劑和羰基類物質(zhì)清除劑以對抗運動性疲勞已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注[914].本研究根據(jù)運動前后氧化應(yīng)激作用和氨基酸濃度變化的特點，采用含有氨基生物活性小分子的復(fù)合氨基酸制劑，聯(lián)合8周遞增負(fù)荷有氧運動訓(xùn)練的方法，從抗羰基應(yīng)激防御體系的角度，探討復(fù)合氨基酸制劑對力竭運動后大鼠腦組織的保護作用，以期為氨基酸抗運動性疲勞機制提供實驗依據(jù).

1材料與方法

1.1實驗對象及分組

健康雄性2月齡SpragueDawley大鼠40只，體質(zhì)量為200±15 g，由湖南斯萊克景達(dá)公司提供（許可證號：動物SCXK（湘）20090004，飼料SCXK（湘）20090009）.用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自由飲水進食，室溫保持20～23 ℃，相對濕度為45%～55%，每兩天換一次墊料，動物房隔天用消毒液消毒.適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為5組（見表1）.每組8只，所有運動組大鼠進行8周遞增負(fù)荷有氧運動訓(xùn)練.

湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報第38卷第6期賀洪等：復(fù)合氨基酸制劑和8周遞增負(fù)荷有氧運動對大鼠腦組織的保護作用表1大鼠分組、給藥方式及劑量一覽表

Tab.1Rat groups of administration method and doses

組別n施加因素處理安靜對照組（C）8灌胃生理鹽水 0.1 mL/10 g 體質(zhì)量，每天運動前1 h灌胃一次（下同）不運動，正常條件下飼養(yǎng)，與運動組同時取材運動對照組（S）8灌胃生理鹽水 0.1 mL/10 g 體質(zhì)量，并進行遞增負(fù)荷有氧運動有氧運動訓(xùn)練8周，最后一次運動至力竭后取材運動+?；撬峤M（ST）8灌胃?；撬?.1 mL/10 g 體質(zhì)量，并進行遞增負(fù)荷有氧運動有氧運動訓(xùn)練8周，最后一次運動至力竭后取材運動+支鏈氨基酸組（SB）8灌胃支鏈氨基酸0.1 mL/10 g 體質(zhì)量，并進行遞增負(fù)荷有氧運動有氧運動訓(xùn)練8周，最后一次運動至力竭后取材運動+復(fù)合氨基酸制劑組（STB）8灌胃復(fù)合氨基酸制劑0.1 mL/10 g體質(zhì)量，并進行遞增負(fù)荷有氧運動有氧運動訓(xùn)練8周，最后一次運動至力竭后取材1.2實驗方案

1.2.1給藥方案每次運動前1 h，運動+支鏈氨基酸組（SB）灌服支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸，等物質(zhì)的量）溶液2 mL[15];運動+?；撬峤M（ST）灌服牛磺酸溶液2 mL[1619];運動+復(fù)合氨基酸制劑組（STB）灌服復(fù)合氨基酸制劑（?；撬?亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸，等物質(zhì)的量）溶液2 mL.為排除灌胃刺激對實驗大鼠的影響，安靜對照組（C）與運動對照組（S）均同時灌服等體積的生理鹽水.

1.2.2運動方案大鼠遞增負(fù)荷有氧運動訓(xùn)練方案，參考并改良了鄭瀾[2021]等有氧運動模型，方案見表2.

表2大鼠8周遞增負(fù)荷有氧運動方案（速度×持續(xù)時間）

Tab.2Eight weeks progressive loads training protocol for rats （Velocity × Duration）

Week星期一星期二星期三星期四星期五星期六星期日1st 15×2515×2515×2516×2516×2516×25休息2nd17×2517×2517×2518×2518×2518×25休息3rd19×3019×3019×3020×3020×3020×30休息4th21×3521×3521×3522×3522×3522×35休息5th23×4023×4023×4024×4024×4024×40休息6th25×4525×4525×4525×4525×4525×45休息7th26×4526×4526×4526×4526×4526×45休息8th26×5026×5026×5026×5026×5026×50取材注：速度：m/min;持續(xù)時間：min;跑臺坡度：10°.

1.3儀器與試劑

主要儀器：低速冷凍離心機（上海市盧湘儀離心機儀器有限公司）;PT動物跑臺（浙江省杭州立泰科技有限公司）; Lambda Bio 40 型紫外可見分光光度計（美國PerkinElmer公司）;F4500型熒光分光光度計（日本Hitach公司）.

主要試劑：MDA，SOD，GSHPx，CAT及組織蛋白定量測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;?；撬?，亮氨酸（Leu），L纈氨酸（Val），L異亮氨酸（Ile）購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司.

1.4標(biāo)本制備及檢測指標(biāo)

沿著大鼠第一頸椎處將脊髓剪斷，沿著枕骨大孔與大鼠耳緣上緣連線處將顱腔剪開，然后取出完整全腦.置于冰生理鹽水中洗凈血液，濾紙吸干，分裝在5 mL離心管中，迅速投入液氮，將腦組織碾磨成白色粉末，制作10%腦組織勻漿，用低溫4 ℃離心機以3 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液測SOD，GSHPx和CAT活性，MDA和羰基化蛋白含量.

1.5腦組織切片制作

用4%多聚甲醛固定后（24 h），用流動水柔和地沖洗30 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，H.E.染色，光鏡下放大400倍觀察腦組織切片病理形態(tài)改變.

1.6統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示.組間差異比較采用方差分析，方差齊性檢驗.方差齊時用LSD法兩兩比較;方差不齊時用秩和檢驗進行統(tǒng)計，顯著性水平α=0.05.

2實驗結(jié)果

2.1腦組織光鏡觀察結(jié)果

400倍光鏡下C組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰完整，神經(jīng)細(xì)胞密集，排列整齊，神經(jīng)元胞漿豐富，淡染，胞核居中，核仁清楚，正常膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無膠質(zhì)細(xì)胞增生，錐體細(xì)胞核大而圓，排列緊密，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞漿無紅染，細(xì)胞周圍間隙致密無水腫（圖1A）;S組細(xì)胞周圍間隙正常，形態(tài)規(guī)則，可見少量神經(jīng)細(xì)胞消失、稀疏，排列不規(guī)則，數(shù)量減少，無水腫（圖1B）;SB組、ST組和STB組無S組上述變化，與對照組C組類似（見圖1C，D和E）.圖中箭頭所示為神經(jīng)元細(xì)胞，中間陰影部分為核仁.

A：C組大鼠腦組織;B：S組大鼠腦組織;C：SB組大鼠腦組織;D：ST組大鼠腦組織;E：STB組大鼠腦組織

圖1實驗大鼠腦組織H.E.染色

Fig.1Experimental rats brain tissue H.E. staining2.2大鼠腦組織SOD、GSHPx、CAT酶活性和MDA、羰基化蛋白含量的比較

腦組織SOD活性測試結(jié)果顯示（見圖2a）：ST組、SB組、STB組與C組比較，SOD活性顯著升高（P<001）;S組與C組比較，SOD活性顯著性增加（P<0.05）.ST組、SB組、STB組與S組比較，SOD活性顯著性升高（P<0.05和P<0.01）;STB組SOD活性最高，但與ST組和SB組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義.

腦組織GSHPx活性測試結(jié)果顯示（見圖2b）：S組、ST組、SB組、STB組與C組相比，GSHPx活性均顯著升高（P<0.01）;同時ST組、SB組、STB組與S組比較，GSHPx活性亦顯著升高（P<0.05和P<0.01）;STB組與ST組、SB組比較，均有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）.

腦組織CAT活性測試結(jié)果顯示（見圖2c）：ST組、SB組、STB組與C組比較，CAT活性顯著升高（P<001）;S組與C組無統(tǒng)計學(xué)意義.同時ST組、SB組、STB組與S組比較，CAT活性顯著升高（P<0.01）;STB組CAT活性最高，與ST組、SB組比較，均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01和P<0.05）.

腦組織MDA和羰基化蛋白含量測試結(jié)果顯示（見圖3）：S組、ST組、SB組、STB組與C組比較，MDA含量顯著降低（P<0.05和P<0.01）;ST組、SB組、STB組與S比較，MDA和羰基化蛋白含量顯著降低（P<005和P<001）;STB組MDA含量最低，與ST組、SB組比較，均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見圖3a）.羰基化蛋白含量以STB組最低，ST組、SB組、STB組與C組、S組進行比較，均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01和P<0.05）;S組與C組相比，STB組與ST組、SB組相比，羰基化蛋白含量降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖3b）.

各組腦組織SOD活性的比較（a）各組腦組織GSHPx活性的比較（b）各組腦組織CAT活性的比較（c）

與C組相比：b.P<0.05;與S組相比：c.P<0.05，d.P<0.01;與SB組相比：e.P<0.05， f.P<001;與ST組相比：g.P<0.05，h.P<001

圖2不同組別大鼠腦組織SOD，GSHPx和CAT活性的比較

Fig.2Comparison of the activities of different groups rats of brain tissue SOD， GSHPx and CAT各組腦組織MDA含量的比較（a）各組腦組織羰基化蛋白含量的比較（b）

與C組相比：a.P<0.05，b.P<0.01; 與S組相比：c.P<0.05，d.P<0.01;與SB組相比：e.P<0.05;與ST組相比：g.P<0.05

圖3不同組別大鼠腦組織MDA和羰基化蛋白含量的比較

Fig.3Comparison of the contents of groups rats of brain tissue MDA and carbonyl protein3討論

近年來對運動負(fù)荷與腦組織形態(tài)兩者間關(guān)系的研究逐漸深入.有研究表明過度負(fù)荷運動會使腦組織缺血缺氧，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷，從而引起中樞疲勞，運動能力下降[22].一次性力竭運動后的12 h，腦組織結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化，大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷明顯[23].白石等[24]對大鼠8周游泳訓(xùn)練后研究結(jié)果與上述一致.牛磺酸對腦組織神經(jīng)細(xì)胞 RNA損傷具有一定的保護作用[25].本研究發(fā)現(xiàn)：復(fù)合氨基酸制劑能顯著提高力竭運動SD大鼠腦組織抗羰基應(yīng)激損傷能力.

本實驗大鼠經(jīng)8 周遞增負(fù)荷跑臺有氧運動訓(xùn)練后，力竭大鼠腦組織形態(tài)學(xué)顯示：C組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰完整，神經(jīng)細(xì)胞密集，排列整齊，神經(jīng)元胞漿豐富，淡染，胞核居中，核仁清楚，正常膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無膠質(zhì)細(xì)胞增生，錐體細(xì)胞核大而圓，排列緊密，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞漿無紅染，細(xì)胞周圍間隙致密無水腫;S組細(xì)胞周圍間隙正常，形態(tài)規(guī)則，可見神經(jīng)細(xì)胞稍稀疏，排列不規(guī)則，數(shù)量減少，無水腫.ST組、SB組和STB組腦組織的形態(tài)基本與對照組C組類似.結(jié)果表明：補充?；撬?、支鏈氨基酸和復(fù)合氨基酸制劑均能夠明顯降低力竭運動大鼠腦組織細(xì)微結(jié)構(gòu)氧化應(yīng)激和羰基應(yīng)激損傷.

機體中存在多種抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)，確保機體在常態(tài)下處于自由基生成與消除的動態(tài)平衡之中.力竭運動中自由基急劇增加，而清除自由基的抗氧化相關(guān)酶類如SOD，GSHPx和CAT的活性下降，可能與引發(fā)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的 RCS攻擊這些酶蛋白導(dǎo)致其失活有密切關(guān)系[26].羰基應(yīng)激是指體內(nèi)活性羰基化合物（RCO）大量增生的狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)羰氨交聯(lián)反應(yīng)可能與運動性疲勞密切相關(guān)[2728].活性羰基物質(zhì)具有較長的半壽期.自由基攻擊生物大分子形成的中間產(chǎn)物不飽和醛酮，即活性羰基類物質(zhì)，其緩慢積累是機體疲勞的關(guān)鍵生化機理[28].運動對于活性羰基類物質(zhì)的應(yīng)激有雙面性，適度的運動可以表現(xiàn)為機體對羰基應(yīng)激的適應(yīng)性和機體對羰基應(yīng)激防御能力的增強，而大強度的運動，將會引起機體運動性疲勞和機體組織的損傷[28].

有研究報道，90 min定量運動組大鼠腦GSHPx，SOD活性升高而對照組下降.長期有氧訓(xùn)練可以清除運動時產(chǎn)生的大量自由基，提高組織抗氧化酶活性，其機理可能是由于在適宜的慢性運動中，抗氧化酶的活性產(chǎn)生適應(yīng)性的變化使機體內(nèi)自由基防御體系加強，因此使機體對羰基應(yīng)激的適應(yīng)性和防御能力增強.尤春英[29]等研究發(fā)現(xiàn)，3周與7周訓(xùn)練組大鼠腦SOD活性均顯著高于對照組;李良鳴等[30]研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸和耐力訓(xùn)練均能提高腦組織SOD活性，能降低力竭運動時大鼠腦組織脂質(zhì)過氧化水平;服用支鏈氨基酸有利于提高機體內(nèi)抗氧化酶的活性，清除機體的自由基，對運動性疲勞的恢復(fù)可能起到積極的作用[3132].本實驗大鼠腦組織中，ST組、SB組和STB組SOD、CAT和GSHPx活性顯著高于S組和C組（P<005和P<001），S組SOD和GSHPx活性顯著高于C組（P<0.05），STB組SOD和GSHPx活性也高于ST組和SB組.結(jié)果表明8周遞增負(fù)荷有氧運動聯(lián)合服用?；撬岷?或氨基酸可顯著提高腦組織SOD，CAT和GSHPx活性，提示?；撬帷⒅ф湴被岷蛷?fù)合氨基酸有提高機體抗氧化酶活性的作用，保護機體減輕受氧化損傷，遞增負(fù)荷有氧運動也有此效果.本實驗結(jié)果與前人的研究基本一致，但發(fā)現(xiàn)給予復(fù)合氨基酸制劑組的效果顯著優(yōu)于單一給予?；撬峤M和支鏈氨基酸組.

活性羰基類物質(zhì)引起動物中樞疲勞的最直接的實驗證據(jù)是MDA經(jīng)椎管注射入紅耳龜，導(dǎo)致紅耳龜?shù)哪X電受到抑制，出現(xiàn)了類似乙醇中毒疲勞樣的腦電變化[33].活性羰基類物質(zhì)的α醛或酮結(jié)構(gòu)與神經(jīng)遞質(zhì)之間的羰氨共價交聯(lián)，是導(dǎo)致機體衰老和疲勞的核心事件[34].活性羰基類物質(zhì)與氨基酸反應(yīng)的作用機制，可能是氨基酸中游離的αNH2與活性羰基物質(zhì)中的α醛或酮共價交聯(lián)形成相對穩(wěn)定的化合物在體內(nèi)過多累積所致.蛋白質(zhì)羰基化是指蛋白質(zhì)肽鏈中的氨基酸在氧化應(yīng)激的情況下，氨基酸中的氨基與氧化副產(chǎn)物中的羰基發(fā)生了羰氨交聯(lián)反應(yīng).8周的遞增負(fù)荷有氧運動能夠使力竭運動大鼠腦組織中ST組、SB組和STB組MDA和羰基化蛋白含量顯著低于S組和C組（P<0.05和P<0.01），S組MDA含量顯著低于C組（P<005），結(jié)果表明有氧運動訓(xùn)練能使機體對羰基應(yīng)激產(chǎn)生適應(yīng)，從而減少羰基毒害損傷，增強羰基應(yīng)激防御能力，Bloomer[35]的研究結(jié)果與本實驗結(jié)果基本一致.而ST組、SB組、STB組與S組比較，MDA和羰基化蛋白含量顯著降低（P<0.05和P<0.01）;STB組MDA和羰基化蛋白含量顯著低于ST和SB組（P<0.01）.結(jié)果表明給予牛磺酸、支鏈氨基酸和復(fù)合氨基酸可顯著降低腦組織MDA和羰基化蛋白含量，但遞增負(fù)荷有氧運動聯(lián)合給予復(fù)合氨基酸制劑效果更顯著.實驗結(jié)果提示：氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)火索，羰基應(yīng)激是主因，是導(dǎo)致失修性分子損變的分子基礎(chǔ)，這反證了復(fù)合氨基酸制劑抗運動性疲勞的主要機制之一，可能是通過補充外源性的氨基酸競爭性地與活性羰基類物質(zhì)發(fā)生羰氨反應(yīng)，從而保護機體免受羰基應(yīng)激傷害.

4結(jié)論

（1） 力竭運動大鼠腦組織H.E.染色形態(tài)學(xué)觀測表明，運動對照組神經(jīng)細(xì)胞稍稀疏，排列不規(guī)則，數(shù)量減少，但無水腫.運動聯(lián)合補充牛磺酸、支鏈氨基酸和復(fù)合氨基酸制劑各組神經(jīng)元細(xì)胞密集、排列整齊、細(xì)胞周圍間隙致密無水腫，其形態(tài)結(jié)構(gòu)與安靜對照組的相同.

（2） 8周遞增負(fù)荷有氧運動能明顯提高大鼠機體組織SOD，CAT及GSHPx的活性，降低腦組織細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度.?；撬?、支鏈氨基酸和復(fù)合氨基酸制劑均具有抗氧化和去羰基應(yīng)激作用，能顯著減少腦組織中糖基化蛋白的含量，從而減少羰基應(yīng)激損傷.

（3） 8周遞增負(fù)荷有氧運動聯(lián)合補充復(fù)合氨基酸制劑能顯著提高力竭運動大鼠清除活性羰基類物質(zhì)的能力，其作用明顯優(yōu)于8周遞增負(fù)荷有氧運動訓(xùn)練和在有氧訓(xùn)練中聯(lián)合補充?；撬峄蛑ф湴被?

（4） 氨基酸抗運動性疲勞的主要機制之一，可能是通過補充外源性的氨基酸競爭性地與活性羰基類物質(zhì)發(fā)生羰氨反應(yīng)，從而保護機體免受羰基應(yīng)激傷害.

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