胃癌中PTEN/PI3K信號(hào)通路蛋白水平的調(diào)節(jié)

周巧輝(綜述)，艾耀偉(審校)

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北宜昌443000)

胃癌作為我國(guó)高發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增高，引起了廣泛關(guān)注。隨著診療技術(shù)的發(fā)展，胃癌的治愈情況較前雖有較大改善，但仍局限于早期患者，對(duì)于大多數(shù)的晚期患者，病情控制及預(yù)后在較大程度上依賴于藥物治療。因此，研究人員致力于早期診斷及新型抗癌藥物的探索，深入了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制是關(guān)鍵。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多個(gè)信號(hào)通路、多項(xiàng)因素共同決定的過(guò)程。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deloted on chromosome ten，PTEN)蛋白在胃癌發(fā)生中的調(diào)控作用已得到公認(rèn)，其中PTEN/磷脂 酰 激 醇 3-激 酶 (phosphatidylinositol 3-kinases PI3K)信號(hào)通路成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，蛋白水平的調(diào)控是該通路調(diào)控的關(guān)鍵?，F(xiàn)對(duì)胃癌中PTEN/PI3K信號(hào)通路蛋白水平的調(diào)節(jié)進(jìn)行綜述。

1 PTEN蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

PTEN基因編碼的蛋白質(zhì)具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶的雙重活性，可通過(guò)磷酸酶依賴的方式調(diào)控細(xì)胞信號(hào)通路;PTEN蛋白的主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有:N端具有酶活性，為主要功能區(qū);C2結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體與底物，介導(dǎo)信號(hào)傳遞;C端含PEST序列(維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定)和PDZ結(jié)構(gòu)域(與蛋白間的作用相關(guān))［1］。PTEN去磷酸化作用可以抑制 PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［2］。若PTEN蛋白缺失或失活，則導(dǎo)致磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸的積蓄，不斷激活蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)通路，引起下游因子效應(yīng)，促使細(xì)胞存活并無(wú)限增殖［3］。在無(wú)其他干擾因素存在的情況下，最終將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

2 PTEN蛋白翻譯后修飾的調(diào)節(jié)

蛋白質(zhì)在翻譯后往往要受到一系列的加工修飾才具備一定的功能，而這些翻譯后修飾也可影響蛋白質(zhì)功能;參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的PTEN蛋白在經(jīng)翻譯修飾作用后，也將對(duì)PTEN/PI3K信號(hào)通路的調(diào)控產(chǎn)生影響。

2.1 磷酸化 磷酸化參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的調(diào)控，PTEN的磷酸化也較為常見(jiàn)。PTEN的磷酸化主要發(fā)生在C端的絲氨酸殘基及少數(shù)的蘇氨酸殘基(如 S380、S370、T382、T383等)，其中S370和S385是主要的磷酸化位點(diǎn)［4-5］。其他的磷酸化位點(diǎn)也存在，但為數(shù)甚少［5］。尾端的磷酸化參與調(diào)節(jié)PTEN的穩(wěn)定性及功能，這種依賴于尾端的調(diào)節(jié)被證明與尾端內(nèi)部3個(gè)殘基(S380、T382和T383)相關(guān)［6］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白存在開(kāi)/關(guān)兩種構(gòu)象，磷酸化的PTEN為關(guān)閉狀態(tài)，可定位于胞質(zhì)膜，繼而發(fā)揮其脂質(zhì)磷酸酶活性;而去磷酸化后，則形成開(kāi)放結(jié)構(gòu)，打開(kāi)磷酸酶結(jié)構(gòu)域，允許膜聯(lián)接，導(dǎo)致降解［7-8］。已經(jīng)證實(shí)數(shù)種磷酸化PTEN的酶(如酪蛋白激酶2、絲氨酸/蘇氨酸激酶11、微管相關(guān)激酶MAT205等)，其磷酸化作用保證了胞內(nèi) PTEN 的定位和穩(wěn)定［9］。Yang等［10］在AGS、MKN-45、MKN-28、SGC-7901 這 4 種胃癌細(xì)胞株中檢測(cè)到去磷酸化的PTEN水平較正常胃黏膜細(xì)胞及慢性胃炎細(xì)胞顯著升高(P＜0.05)，并指出PTEN在Ser380殘基端的去磷酸化導(dǎo)致PTEN蛋白失活，從而促使早期胃癌的發(fā)生。可見(jiàn)Ser380處的磷酸化是PTEN蛋白穩(wěn)定及活性的重要保證。

2.2 泛素化 泛素化也是蛋白質(zhì)一種常見(jiàn)的翻譯后修飾方式，目前的研究主要集中在其促降解作用;在泛素活化酶E1、泛素轉(zhuǎn)移酶E2和泛素蛋白連接酶E3依次作用下，將泛素結(jié)合到蛋白質(zhì)的特異性氨基酸殘基上而導(dǎo)致蛋白的降解是經(jīng)典的泛素化降解線路［11］。研究表明，PTEN同樣存在此種降解方式，其中連接酶E3是降解機(jī)制中的關(guān)鍵因素，其可識(shí)別目標(biāo)降解蛋白，一般認(rèn)為是發(fā)生多聚泛素化而導(dǎo)致降解［12］。這在Wang等［13-14］的研究中得到證實(shí)，NEDD4-1(neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 4)作為 PTEN的泛素連接酶，與PTEN C2區(qū)的第13和289賴氨酸殘基結(jié)合，催化PTEN形成多聚泛素化鏈而走向降解。有趣的是，NEDD4-1也可使PTEN發(fā)生單泛素化，從而介導(dǎo)進(jìn)入核內(nèi)，對(duì)PTEN起保護(hù)作用，而對(duì)胞質(zhì)內(nèi)PTEN作用也有利［15］。隨后，Kim等［16］證實(shí)在胃癌和結(jié)腸癌中NEDD4-1與PTEN的相互作用，但結(jié)果偏向于促降解作用。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，NEDD4-1并不是PTEN泛素化所必需的［17］，也存在其他的E3連接酶(如XIAP［18］)，同樣也可以完成PTEN的泛素化過(guò)程。近年有研究者提出一種泛素相關(guān)調(diào)節(jié)因子小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)，其在結(jié)構(gòu)上與泛素分子相似，結(jié)合部在PTEN C2區(qū)的266與289賴氨酸殘基，反應(yīng)同樣需要 E1、E2、E3 3種酶參與，PTEN-SUMO可以降低泛素分子結(jié)合能力，減少泛素化［19］?？梢?jiàn)，泛素化在PTEN的調(diào)節(jié)中有降解作用，也有穩(wěn)定作用，而且此過(guò)程也不是完全不可逆的，參與減少泛素化反應(yīng)的酶還有待不斷挖掘。磷酸化與泛素化作為常見(jiàn)的翻譯后修飾，兩者之間作用必然有所交叉，Maccario等［20］的一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTEN定位于胞質(zhì)膜可促使其泛素化，但在體外實(shí)驗(yàn)中，若PTEN被磷酸化則無(wú)法發(fā)生泛素化，從而得出PTEN蛋白C端的絲氨酸/蘇氨酸殘基端磷酸化引起的質(zhì)膜定位間接影響隨后的泛素化;同時(shí)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是單泛素化還是多聚泛素化，都將降低PTEN的磷酸酶活性，所以泛素化在此對(duì)PTEN是一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制。磷酸化和泛素化在很多信號(hào)通路中都存在，它們可以反向調(diào)節(jié)，也可協(xié)同作用。因此，在PTEN/PI3K通路中關(guān)于磷酸化和泛素化相互作用的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

2.3 乙酰化 PCAF是一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)與p300/CBP(CREB binding protein)及其他轉(zhuǎn)錄因子序列作用而影響基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控蛋白的合成［21］。然而，PCAF也可與翻譯后的PTEN蛋白作用，Okumura等［22］利用串聯(lián)親和提純法結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定法搜尋細(xì)胞內(nèi)含有的PTEN蛋白復(fù)合物時(shí)發(fā)現(xiàn)PCAF，結(jié)合部在PTEN的賴氨酸殘基，使其發(fā)生乙酰化后而失活，最終抑制PTEN調(diào)控作用;推測(cè)其原因可能有兩種，一是由于PTEN的結(jié)構(gòu)域由于乙?；揎検艿礁蓴_而無(wú)法與底物結(jié)合;二是可能加上賴氨酸殘基后使其催化區(qū)的正電荷消失而無(wú)法與帶負(fù)電荷的底物連接;當(dāng)利用小干擾RNA減少內(nèi)源性PCAF后，即使有生長(zhǎng)因子的刺激，也無(wú)法達(dá)到PTEN的乙?；?推測(cè)可能的機(jī)制是由于在表皮生長(zhǎng)因子的刺激下，細(xì)胞周期發(fā)生改變，從而激活 PCAF，使PTEN乙?；Щ睿?2］。Ikenoue等［23］的研究顯示，PTEN 可以通過(guò) C 端 PDZ結(jié)構(gòu)域的Lys402，識(shí)別并結(jié)合蛋白而發(fā)生乙?；?同時(shí)在COS7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)可使PTEN乙?；腃BP和有去乙?；饔玫腟IRT1(sirtuin type 1)。

3 PTEN/PI3K中主要結(jié)合蛋白的調(diào)控

磷酸磷脂酞肌醇RAC交換因子(P-Rex2a)在人類多數(shù)腫瘤中大量存在，是一種可直接與PTEN結(jié)合的蛋白，結(jié)合后使PTEN失去脂質(zhì)磷酸酶活性而激活PI3K/Akt信號(hào)通路，被認(rèn)為是一種癌蛋白;P-ReX2a具有DH-PH結(jié)構(gòu)域(與GEF的活性有關(guān))，還有PDZ、DPH結(jié)構(gòu)域，C端肌醇4多聚磷酸酶差異較大［24］。Fine等［24］通過(guò)標(biāo)記方法檢測(cè)到 PTEN 的 C2 尾端而不包括PDZ區(qū)參與結(jié)合，在體外實(shí)驗(yàn)中P-ReX2a只是與GEF的活性區(qū)域(PH和DH結(jié)構(gòu)域)有關(guān);兩者結(jié)合后可能由于C2結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的膜聯(lián)失敗而無(wú)法效應(yīng)，具體機(jī)制尚不明確。而且，P-Rex2a在胃癌中的存在最近也得到證實(shí)，與在其他腫瘤中所起作用類似［25］，P-Rex2a在胃癌中調(diào)節(jié)機(jī)制的研究意義重大。PICT-1(protein interacting with carboxyl terminus 1)是一種含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白，在細(xì)胞內(nèi)與PTEN的C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，調(diào)控PTEN的磷酸酶活性及逆轉(zhuǎn);利用RNA干擾技術(shù)將PICT-1失活后，PTEN活性降低并迅速降解，并且若PTEN的C端發(fā)生腫瘤性突變，則失去與PICT-1的結(jié)合能力，這可能是PTEN得以快速逆轉(zhuǎn)的機(jī)制所在［26］。此后，又有研究發(fā)現(xiàn)，剔除PTEN陰性細(xì)胞中的PICT-1后未出現(xiàn)細(xì)胞增殖，說(shuō)明PICT-1通過(guò)與PTEN作用而調(diào)控PI3K途徑［27］。PICT-1原本是一種核仁蛋白質(zhì)，在核仁內(nèi)的定位要兩種獨(dú)立的定位序列結(jié)構(gòu)，而且需要特定的條件［28］;因此，如何使PICT-1從核仁釋放也是值得去研究的。有研究者在研究線蟲(chóng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，受體酪氨酸激酶VAB-1可磷酸化PTEN，從而降低PTEN蛋白水平和抑制其生理功能，而PTEN的蛋白磷酸酶活性可對(duì)抗VAB-1活性［29］。然而，若要將VAB-1與人類癌癥聯(lián)系起來(lái)，還需要更多的研究去證實(shí)。這些都與PTEN蛋白直接結(jié)合而起作用，當(dāng)然遠(yuǎn)不止上述數(shù)種蛋白。這些結(jié)合蛋白與氨基酸殘基結(jié)合使PTEN失活;或與C2結(jié)構(gòu)域結(jié)合影響其膜聯(lián)功能;或與PDZ結(jié)合，影響其穩(wěn)定性，從而在各方面影響PTEN的功能。有些蛋白的作用僅僅是在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的，因此還需要更多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

4 PTEN/PI3K調(diào)控與胃癌藥物治療

胃癌的病理進(jìn)程往往先于癥狀，許多患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，因此對(duì)化療的依賴性較大。但隨著抗癌治療藥物的發(fā)展，繼化療不良反應(yīng)之后，腫瘤耐藥問(wèn)題亦日益明顯，提高藥物敏感性成為一大研究熱點(diǎn)。PI3K的激活促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，與抗癌藥物作用相拮抗，是腫瘤產(chǎn)生耐藥的一個(gè)關(guān)鍵所在;PI3K/AKT通路在腫瘤耐藥中的重要作用，在胃癌細(xì)胞中已得到證實(shí)［30］。隨后，在用阿霉素作用于胃癌細(xì)胞SGC7901時(shí)發(fā)現(xiàn)，阿霉素通過(guò)激活PI3K/Akt/MDM2通路而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，當(dāng)使用PI3K抑制劑時(shí)，癌細(xì)胞藥物敏感性明顯提高［31］。可見(jiàn)，PTEN/PI3K信號(hào)通路調(diào)節(jié)與腫瘤耐藥機(jī)制密切相關(guān)，了解此通路中各種調(diào)節(jié)因子及其作用方式，將為臨床提高藥物敏感性、制訂個(gè)體化治療方案提供理論基礎(chǔ)。

5 小結(jié)

胃癌中PTEN/PI3K信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、分化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，參與調(diào)控的分子眾多且機(jī)制復(fù)雜。PTEN/PI3K通路在蛋白水平的調(diào)控及各種蛋白結(jié)合后產(chǎn)生的正向或負(fù)向效應(yīng)還需要更多討論。需要說(shuō)明的是這些調(diào)控作用并不是單獨(dú)存在的，相關(guān)的各種信號(hào)通路之間也存在“串話”的可能，需要有全局觀念，這樣的研究才能更接近臨床，為臨床治療服務(wù)。

［1］Hlobilková A，Knillová J，Bártek J，et al.The mechanism of action of the tumour suppressor gene PTEN［J］.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2003，147(1):19-25.

［2］Stambolic V，Suzuki A，de la Pompa JL，et al.Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor PTEN［J］.Cell，1998，95(1):29-39.

［3］Maehama T，Dixon JE.The tumor suppressor，PTEN/MMAC1，dephosphorylates the lipid second messenger，phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate［J］.J Biol Chem，1998，273(22):13375-13378.

［4］Torres J，Pulido R.The tumor suppressor PTEN Is phosphorylated by the protein kinase CK2 at its C terminus［J］.J Biol Chem，2001，276(2):993-998.

［5］Miller SJ，Lou DY，Seldin DC，et al.Direct identification of PTEN phosphorylation sites［J］.FEBS Lett，2002，528(1/3):145-153.

［6］Vazquez F，Ramaswamy S，Nakamura N，et al.Phosphorylation of the PTEN tail regulates protein stability and function［J］.Mol Cell Biol，2000，20(14):5010-5018.

［7］Rahdar M，Inoue T，Meyer T，et al.A phosphorylation-dependent intramolecular interaction regulates the membrane association and activity of the tumor suppressor PTEN［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(2):480-485.

［8］Ross AH，Gericke A.Phosphorylation keeps PTEN phosphatase closed for business［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(5):1297-1298.

［9］Gericke A，Munson M，Ross AH.Regulation of the PTEN phosphatase［J］.Gene，2006，374:1-9.

［10］Yang Z，Yuan XG，Chen J，et al.Reduced expression of PTEN and increased PTEN phosphorylation at residue Ser380 in gastric cancer tissues:a novel mechanism of PTEN inactivation［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2013，37(1):72-79.

［11］Burger AM，Seth AK.The ubiquitin-mediated protein degradation pathway in cancer:therapeutic implications［J］.Eur J Cancer，2004，40(15):2217-2229.

［12］Wang X，Jiang X.Post-translational regulation of PTEN［J］.Oncogene，2008，27(41):5454-5463.

［13］Wang X，Trotman LC，Koppie T，et al.NEDD4-1 is a proto-oncogenic ubiquitin ligase for PTEN［J］.Cell，2007，128(1):129-139.

［14］Wang X，Shi Y，Wang J.et al.Crucial role of the C-terminus of PTEN in antagonizing NEDD4-1-mediated PTEN ubiquitination and degradation［J］.Biochem J，2008，414(2):221-229.

［15］Trotman LC，Wang X，Alimonti A，et al.Ubiquitination regulates PTEN nuclear import and tumor suppression［J］.Cell，2007，128(1):141-156.

［16］Kim SS，Yoo NJ，Jeong EG，et al.Expression of NEDD4-1，a PTEN regulator，in gastric and colorectal carcinomas［J］.APMIS，2008，116(9):779-784.

［17］Fouladkou F，Landry T，Kawabe H，et al.The ubiquitin ligase Nedd4-1 is dispensable for the regulation of PTEN stability and localization［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(25):8585-8590.

［18］Van Themsche C，Leblanc V，Parent S，et al.X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP)regulates PTEN ubiquitination，content，and compartmentalization［J］.J Biol Chem，2009，284(31):20462-20466.

［19］González-Santamaría J，Campagna M，Ortega-Molina A，et al.Regulation of the tumor suppressor PTEN by SUMO［J］.Cell Death Dis，2012，3:e393.

［20］Maccario H，Perera NM，Downes CP，et al.Ubiquitination of PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog)inhibits phosphatase activity and is enhanced by membrane targeting and hyperosmotic stress［J］.J Biol Chem，2010，285(17):12620-12628.

［21］Nakatani Y.Histone acetylases--versatile players［J］.Genes Cells，2001，6(2):79-86.

［22］Okumura K，Mendoza M，Bachoo RM，et al.PCAF modulates PTEN activity［J］.J Biol Chem，2006，281(36):26562-26568.

［23］Ikenoue T，Inoki K，Zhao B，et al.PTEN acetylation modulates its interaction with PDZ domain［J］.Cancer Res，2008，68(17):6908-6912.

［24］Fine B，Hodakoski C，Koujak S，et al.Activation of the PI3K pathway in cancer through inhibition of PTEN by exchange factor P-REX2a［J］.Science，2009，325(5945):1261-1265.

［25］Guo B，Liu L，Yao J，et al.miR-338-3p suppresses gastric cancer progression through a PTEN-AKT axis by targeting P-REX2a［J］.Mol Cancer Res，2014，12(3):313-321.

［26］Okahara F，Ikawa H，Kanaho Y，et al.Regulation of PTEN phosphorylation and stability by a tumor suppressor candidate protein［J］.J Biol Chem，2004，279(44):45300-45303.

［27］Okahara F，Itoh K，Nakagawara A，et al.Critical role of PICT-1，a tumor suppressor candidate in phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate signals and tumorigenic transformation［J］.Mol Biol Cell，2006，17(11):4888-4895.

［28］Kalt I，Levy A，Borodianskiy-Shteinberg T，et al.Nucleolar localization of GLTSCR2/PICT-1 Is mediated by multiple unique nucleolar localization sequences［J］.PLoS One，2012，7(1):e30825.

［29］Brisbin S，Liu J，Boudreau J，et al.A role for C.elegans Eph RTK signaling in PTEN regulation［J］.Dev Cell，2009，17(4):459-469.

［30］Yu HG，Ai YW，Yu LL，et al.Phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway plays an important role in chemoresistance of gastric cancer cells against etoposide and doxorubicin induced cell death［J］.Int J Cancer，2008，122(2):433-443.

［31］艾耀偉，于紅剛.PI3K/AKT/MDM2信號(hào)通路活化影響胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華腫瘤雜志，2008，30(7):494-497.