登革病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測研究進(jìn)展

李　娜(綜述)，楊恒林(審校)

(1.大理學(xué)院病原與媒介生物研究所，云南 大理 671003； 2.云南省寄生蟲病防治所/云南瘧疾研究中心，云南 普洱 665000)

登革病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測研究進(jìn)展

李娜1△(綜述)，楊恒林1,2※(審校)

(1.大理學(xué)院病原與媒介生物研究所，云南 大理 671003； 2.云南省寄生蟲病防治所/云南瘧疾研究中心，云南 普洱 665000)

登革熱是登革病毒引起的急性蟲媒傳染病。感染輕者無臨床癥狀，是一種重要的傳染源；重者表現(xiàn)為登革出血熱，登革休克綜合征甚至“重癥登革熱”等病死率較高的臨床類型[1-3]。近些年，登革熱的流行呈上升趨勢，已經(jīng)波及到熱帶、亞熱帶的100多個(gè)國家和地區(qū)[4]。在東南亞、太平洋和美洲，每年約有5000萬登革感染者和50萬患者因登革出血熱而需住院治療[5]。據(jù)報(bào)道，2012年泰國共出現(xiàn)7.4萬登革病例，其中79例死亡[6]。我國從1980年后，登革熱幾乎每年都會(huì)在廣東、廣西、海南及福建等地發(fā)生不同程度的流行[3,7]。

1登革病毒結(jié)構(gòu)

登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，完整的登革病毒顆粒呈球形、近似二十面體立體對(duì)稱，有包膜。登革病毒基因組為單股正鏈RNA，長度約10.6 kb[8]，分5′端非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)、非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structural,NS)編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)4個(gè)部分。3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白是衣殼蛋白、膜蛋白及其前體和包膜蛋白；7個(gè)NS分別為NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5[8-9]。包膜蛋白大部分位于包膜的外表面，形成多個(gè)小突起，是登革病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白。作為一種抗原，它主要負(fù)責(zé)吸附和進(jìn)入細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。病毒學(xué)家們根據(jù)包膜蛋白的不同抗原性利用血清中和試驗(yàn)將登革病毒分為4種血清型[10]。包膜蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為55 000，有3個(gè)不同區(qū)域的糖蛋白。利用X射線晶體學(xué)，在登革病毒2型和3型上存有這些區(qū)域，而域Ⅱ是非常重要的，因?yàn)樗写罅康狞S病毒組和子組交叉反應(yīng)的抗原決定簇[8]。病毒的衣殼蛋白具有特異的抗原決定簇，一般不誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，為補(bǔ)體結(jié)合性抗原；前體蛋白是膜蛋白的前體，在病毒成熟過程中經(jīng)特異性酶切后形成膜蛋白，它能使病毒感染增強(qiáng)，并形成病毒的表面結(jié)構(gòu)。NS的作用至今尚不清楚[11]。

2發(fā)病機(jī)制

登革病毒感染人體后，在單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制,最終進(jìn)入血液[8]。疾病的嚴(yán)重程度似乎與病毒感染這些細(xì)胞的能力有關(guān)。一種血清型的登革病毒感染機(jī)體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，使機(jī)體對(duì)該型登革病毒獲得免疫力，但增強(qiáng)了被異型登革病毒感染的能力[2]。也有學(xué)者認(rèn)為，該抗體對(duì)機(jī)體感染異型病毒有部分或短暫的保護(hù)作用[12]。隱性感染者或患者被伊蚊叮咬后，病毒在伊蚊的唾液腺及神經(jīng)細(xì)胞中大量復(fù)制而獲得感染力[13-14]。有文獻(xiàn)指出,登革病毒還可通過母嬰垂直傳播和輸血傳播[15]。

對(duì)于發(fā)病機(jī)制近些年存在幾種假說。較為流行的“二次感染學(xué)說”認(rèn)為當(dāng)人體初次感染某一型的登革病毒后，人體對(duì)同型的病毒可產(chǎn)生免疫力并可維持1～4年[16]。在免疫力還存在的情況下，患者再次感染登革異型病毒時(shí)，病毒在血液中與原有抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，引起組織免疫損傷，臨床表現(xiàn)為出血或休克。Rosen[17]認(rèn)為,登革出血熱和登革休克綜合征的發(fā)生是受一種毒力更強(qiáng)的登革病毒感染。目前普遍認(rèn)為登革病毒3型的毒力最強(qiáng)，2型和4型次之，1型最弱。病毒通過變異產(chǎn)生毒力更強(qiáng)的病毒株，但這種假說并不能闡明登革出血熱和登革休克綜合征的發(fā)病機(jī)制[18]。

3實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1血清學(xué)檢測方法傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法包括血凝抑制試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和中和試驗(yàn)，目前也有許多針對(duì)于抗原抗體檢測的技術(shù)方法。

血凝抑制試驗(yàn)敏感性高、重復(fù)性好、操作簡便,曾被認(rèn)為是登革病毒血清學(xué)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。但它有諸多缺點(diǎn)：需預(yù)處理待檢血清、準(zhǔn)確的血凝抑制試驗(yàn)需要雙份血清樣本且雙樣本的滴度相差至少4倍方可確認(rèn)為近期感染、易發(fā)生交叉反應(yīng)，所以它逐漸被IgM、IgG抗體測定法取代[19-20]。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是一種古老的方法，復(fù)雜費(fèi)時(shí)、敏感性和特異性差，現(xiàn)已少用[19]。中和試驗(yàn)可進(jìn)行病毒的鑒定，是登革病毒血清學(xué)診斷上最特異、最敏感的方法，但它只能對(duì)初次感染者進(jìn)行型別鑒定，而且成本高、耗時(shí)長、對(duì)實(shí)驗(yàn)者技術(shù)要求高，操作繁瑣，通常不用做診斷[21-22]。

NS1抗原是感染登革病毒的標(biāo)志性抗原，它可早于IgM抗體出現(xiàn)[23]，在感染病毒以后，從發(fā)熱的第1日開始，人體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)NS1抗原，可維持9 d，該抗原對(duì)早期診斷有重要意義。目前國外已有商品化的試劑盒用于登革病毒NS1抗原的檢測。我國也研發(fā)了一些該類檢測試劑，但還沒有對(duì)這些檢測試劑進(jìn)行過全面、客觀的臨床評(píng)價(jià)，對(duì)其敏感性、特異性了解甚少，所以這些檢測試劑還未獲得國家有關(guān)部門的注冊登記，無法用于登革熱臨床檢測。IgM和IgG抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是最廣泛的登革病毒感染的血清學(xué)方法,但是它測試的結(jié)果還需要第二份恢復(fù)期的血清進(jìn)行確認(rèn)。而且, 此方法在抗體滴度沒有明顯上升的發(fā)熱期間沒有作用[24-25]；此外，與其他密切相關(guān)的蟲媒病毒存在交叉反應(yīng)也是一個(gè)常見的問題。但是間接檢測登革病毒IgM抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種靈敏、特異、快速的定性檢測方法，可作為臨床登革熱診斷的輔助措施。

3.2登革病毒的分離培養(yǎng)確診登革病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷是基于病毒特異性抗體的檢測以及病毒的分離培養(yǎng)，但這些方法在早期診斷、敏感性以及快速性都不夠理想。蚊培養(yǎng)細(xì)胞等培養(yǎng)分離出登革病毒曾被認(rèn)為是確診登革病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，此方法不但能確診是登革病毒感染，而且能鑒別出不同的血清型[26-29]。登革熱的病毒血癥期通常在發(fā)熱2～5 d內(nèi)，因此分離病毒應(yīng)在發(fā)病后的4～5 d進(jìn)行，耗時(shí)長，一般需要5～10 d[23,30-31],這樣達(dá)不到快速早期診斷的目的。又因?yàn)閷?duì)標(biāo)本的儲(chǔ)存和運(yùn)輸要求嚴(yán)格，需要專業(yè)的人員和設(shè)備，因此很難在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。其靈敏度僅為40.5%。為提高靈敏度和縮短鑒定時(shí)間，目前實(shí)踐中該方法正逐步被反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)等快速診斷方法所代替[23，26]。

3.3分子生物學(xué)技術(shù)分子技術(shù)檢測病毒基因組RNA序列正逐步被接受為檢測登革病毒的新標(biāo)準(zhǔn)，主要通過RT-PCR和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)對(duì)急性期患者的血清進(jìn)行檢測。PCR方法敏感性、特異性和重復(fù)性較高，且快速簡便[22]，在登革病毒感染早期，可以用這種方法對(duì)登革病毒進(jìn)行檢測以及鑒定病毒型別,對(duì)分析登革病毒的傳播、變異有重要的意義。與常規(guī)PCR相比，qRT-PCR更適用于登革病毒的實(shí)驗(yàn)室快速早期診斷，在發(fā)病第2日即可檢測出登革病毒核酸。熊建英等[32]利用qRT-PCR和常規(guī)PCR對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明qRT-PCR比常規(guī)PCR方法更加靈敏，耗時(shí)更短。但是,昂貴的核酸擴(kuò)增儀和高水平的技能，限制了這些方法在資源有限的農(nóng)村醫(yī)療機(jī)構(gòu)中的應(yīng)用。

Teoh等[24]發(fā)展和改進(jìn)了環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增對(duì)登革病毒的檢測方法，此方法對(duì)擴(kuò)增的基因組序列敏感性高、不需要專門的設(shè)備，只需要一個(gè)能保持在60～65 ℃的恒溫裝置，被認(rèn)為是各種傳染性病原體包括登革病毒的檢測方法。Carter等[33]研究了利用納米技術(shù)檢測登革病毒基因組RNA的方法:使脫氧核酶和納米金粒耦合，當(dāng)遇到登革病毒時(shí)，納米金粒就快速的聚集形成一個(gè)由紅色逐漸變?yōu)闊o色的反應(yīng)混合物，從而檢測出登革病毒。這為早期檢測提供了一個(gè)低成本、快速可行的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。由于脫氧核酶被設(shè)計(jì)為能識(shí)別所有的登革病毒的5′端環(huán)化序列，所以此方法不能對(duì)登革病毒進(jìn)行分型。

4小結(jié)

全球登革熱流行日趨嚴(yán)重，登革病毒的基因多樣性也在增加，人類將長期受到更多樣的致病性登革病毒的攻擊。這為登革熱快速診斷試劑提出更高的要求。目前的研究成果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)登革熱檢測的需要。特別是我國目前還沒有通過國家注冊的登革熱診斷試劑，這制約了登革患者的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)隔離治療，導(dǎo)致由于傳染源積累而引起的暴發(fā)流行。為改變這種被動(dòng)局面，我國急需對(duì)國產(chǎn)和進(jìn)口的快速診斷進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，為獲得國家注冊提供科學(xué)依據(jù)，以使那些敏感性、特異性好、價(jià)格低廉的試劑盡快得到注冊。

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腫瘤醫(yī)學(xué)

摘要：登革熱是由登革病毒引起的，主要通過媒介伊蚊叮咬而傳播的急性傳染病。登革熱主要流行于熱帶、亞熱帶等適于伊蚊生長繁殖的國家和地區(qū)。近年來，登革病毒流行范圍愈加擴(kuò)大，嚴(yán)重危害人類的生命與健康。目前全球缺乏特效抗登革病毒藥物和理想的登革病毒疫苗,我國迄今沒有國家注冊的診斷(檢測)試劑。加強(qiáng)傳播媒介監(jiān)控,及時(shí)發(fā)現(xiàn)、隔離與治療患者是防止登革熱暴發(fā)流行，減少重癥患者和死亡的主要措施。作為及時(shí)發(fā)現(xiàn)、確診登革熱患者的主要方法，快速準(zhǔn)確的檢測是登革病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的主要研究方向。

關(guān)鍵詞：登革熱;登革病毒;實(shí)驗(yàn)室檢測

Research Progress of Laboratory Detection of Dengue VirusLINa1,YANGHeng-lin1,2. (1.InstituteofPathogensandVectorsofDaliUniversity,Dali671003,China; 2.YunnanInstituteofParasiticDiseases/MalariaResearchCenterofYunnanProvince,Pu′er665000,China)

Abstract:Dengue fever is an acute infectious disease caused by dengue virus and transmitted by aedeses.Dengue fever is mainly epidemic in tropical and subtropical countries or regions which are suitable for the growth and reproduction of aedeses.The epidemic area of dengue virus is extending in recent years,gravely threatening the human life and health. So far there are still no dedicated antiviral drugs and ideal vaccines to dengue virus globally and no national registered diagnostic reagents in China. The main measures to prevent prevalence and outbreak of dengue fever and to reduce the number of severe patients and death are to strengthen the monitoring and control of dengue media,isolate and treat the patients. As a primary measure to discover and confirm dengue patients,rapid and accurate detection is the main direction of research on the laboratory detection of dengue virus.

Key words:Dengue fever; Dengue virus; Laboratory detection

收稿日期：2012-07-21修回日期：2014-10-29編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.06.014

中圖分類號(hào)：R373.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)06-0997-03