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    親和體分子在影像、治療和生物技術(shù)中的應(yīng)用

    2015-12-10 05:02:10王樂丹張麗芳
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2015年10期
    關(guān)鍵詞:噬菌體靶向特異性

    王樂丹 張麗芳

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    親和體分子在影像、治療和生物技術(shù)中的應(yīng)用

    王樂丹 張麗芳

    親和體(affibody)分子由58個氨基酸組成,蛋白相對分子質(zhì)量約為6.5kDa,其來自于金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)B結(jié)構(gòu)域。含有3個α螺旋結(jié)構(gòu),其中該親和體分子的第1及第2螺旋中含有13個特定位點(diǎn)的氨基酸,并且這些氨基酸可隨機(jī)突變,對其結(jié)構(gòu)無明顯影響,形成可以與任何分子結(jié)合的親和體文庫。親和體的功能和抗體類似,但也有一些性質(zhì)是抗體所沒有的:如相對分子質(zhì)量小、高親和力、折疊速率快、理化性能穩(wěn)定、能經(jīng)受受化學(xué)修飾等特點(diǎn),因此有人稱其為“人工抗體”,在治療、診斷和生物技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。

    親和體 治療 診斷 生物技術(shù)

    親和體(affibody)是一種衍生于葡萄球菌A 蛋白Z 結(jié)構(gòu)域的人工蛋白質(zhì)分子。為單鏈結(jié)構(gòu),由58 個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量約為6.5kDa,形成3 個α 螺旋結(jié)構(gòu),其中第1及第2螺旋中的13 個特定位點(diǎn)的氨基酸對其結(jié)構(gòu)無明顯影響,分別是Q9(谷氨酰胺)、Q10(谷氨酰胺)、N11(天冬酰胺)、F13(苯丙氨酸)、Y14(酪氨酸)、L17(亮氨酸)、H18(組氨酸)、E24(谷氨酸)、E25(谷氨酸)、R27(精氨酸)、N28(天冬酰胺)、Q32(谷氨酰胺)、K35(賴氨酸),用簡并密碼子NNK(K=G 或者T,包含32 種密碼子,囊括了20 種氨基酸)替換這13 個氨基酸的密碼子,形成很多轉(zhuǎn)化體,理論上包含3213個基因序列和2013個氨基酸序列,這些轉(zhuǎn)化體也就組成了affibody文庫,用該文庫對靶標(biāo)進(jìn)行篩選,可獲得能與靶標(biāo)特異結(jié)合的親和體[1]。

    篩選獲得的親和體與靶分子的結(jié)合與抗體和抗原的結(jié)合特性相似,但與抗體相比,又具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢,如:獲得方法簡便,通過體外篩選即可獲得;容易制備,以化學(xué)合成方法或原核表達(dá)即可大量制備;同時因為其分子質(zhì)量小,在生物體內(nèi)組織穿透性強(qiáng),并且通過血液后,血漿清除率高,而且親和體分子理化性質(zhì)穩(wěn)定,可以通過將其交聯(lián)或融合表達(dá)與標(biāo)記分子(如熒光蛋白、生物素等)結(jié)合而不影響其與靶分子的結(jié)合能力,基于以上這些特性,親和體有望作為抗體的替代品,用于蛋白質(zhì)識別、分離及純化、實(shí)驗診斷、分子顯像及靶向治療等[2]。在本文中,我們將回顧親和體分子作為一種可行的,有時甚至比抗體更好的替代品,在治療、體內(nèi)成像和生物技術(shù)中的應(yīng)用。

    一、親和體的展示方法

    親和體的展示方法包括噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、細(xì)胞展示技術(shù)及蛋白質(zhì)互補(bǔ)分析技術(shù)等,其中以噬菌體展示技術(shù)最為常見。

    噬菌體展示技術(shù)是以改造的噬菌體為載體,在噬菌體外殼蛋白基因區(qū)定向插入待選的基因片段,使噬菌體表面能展示這些外源多肽或表達(dá)的蛋白質(zhì),通過多次淘洗的方法,進(jìn)一步富集表達(dá)有這些多肽或蛋白質(zhì)的噬菌體,從而得到具有特異性結(jié)合的多肽或蛋白質(zhì)的一種生物學(xué)技術(shù)[3]。噬菌體展示技術(shù)最大的特點(diǎn),是基因型能直接反映表達(dá)型,而且在噬菌體表面展示的外源多肽或蛋白質(zhì)不影響噬菌體的天然構(gòu)型及生活周期。目前這項技術(shù)已經(jīng)成功篩選了Aβ、EGFR、 HER-2等多種靶蛋白親和體。

    核糖體展示技術(shù)(ribosome display technology, RDT)是一種利用功能性蛋白間相互作用而進(jìn)行篩選的新技術(shù),它是在多聚核糖體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。最早由Plückthun 實(shí)驗室首先提出,他們將折疊正確的蛋白及其相應(yīng) mRNA同時結(jié)合在核糖體上, 形成蛋白質(zhì)-核糖體-mRNA的三聚體,使目的蛋白的表型和基因型聯(lián)系起來,常用于抗體及蛋白質(zhì)文庫的選擇、蛋白質(zhì)體外改造等[4]。

    親和體文庫也可以直接展示在細(xì)胞表面,細(xì)胞展示和噬菌體展示類似,但細(xì)胞比噬菌體大,可使用定量流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行文庫排序和篩選后的鑒定[5]。有研究人員將親和體文庫在革蘭陽性細(xì)菌肉葡萄球菌中表達(dá)并且展示在細(xì)胞表面,進(jìn)行TNF-α親和體的篩選。新近發(fā)展起來的另一個篩選方法是蛋白質(zhì)互補(bǔ)分析(PCA),它通常用于研究天然蛋白質(zhì)間相互作用。相比其他展示系統(tǒng),這種方法的靶標(biāo)是在細(xì)胞內(nèi),從而避免了靶蛋白的生產(chǎn)和純化過程[6]。另外,由于 PCA是通過介質(zhì)中存活克隆來篩選陽性克隆,故可以通過簡單的培養(yǎng)完成特異親和體的篩選。

    二、親和體的應(yīng)用

    1.在影像學(xué)中的應(yīng)用:在目前常規(guī)臨床實(shí)踐中,重要的診斷手段有解剖成像,例如計算機(jī)斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI),也有分子水平上功能性或分子成像,如單光子發(fā)射光譜儀(SPECT)或正電子發(fā)射斷層掃描(PET)。分子成像研究中的絕大部分是使用葡萄糖類似物進(jìn)行的2 - [18F]氟-2 - 脫氧-D-葡萄糖(18F-FDG PET),其對檢測轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性疾病及其有用[7]。然而,18F-FDG PET的結(jié)果是非特異性的,不能鑒別癌細(xì)胞表面特異性受體,如人表皮生長因子受體2(HER-2),因此不能用于靶向治療。理想的成像劑應(yīng)具有特異性和親和性。此外,快速的生物分布和組織滲透,使局部濃度富集,以及未結(jié)合示蹤劑快速清除,從而形成高對比度的腫瘤成像[8]。最近的研究表明,親和體分子具有最佳示蹤劑的特性,在HER-2特異性分子成像中,親和體分子可以在給藥后的第1個小時內(nèi)找到并結(jié)合到靶標(biāo),而且未結(jié)合部分血液清除率快。

    親和體分子的第1例特異性放射性標(biāo)記是Orlova[9]報道的。在這項研究中,親和體分子ZHER-2:342是通過合成制備的肽,將具有DOTA的一個化學(xué)過程耦合到N末端,得到DOTA-ZHER-2:342-PEP2(ABY-002)。 ABY-002是有效的,穩(wěn)定的溫度為60~90℃。111In - ABY-002在SKOV-3荷瘤小鼠體內(nèi)的分布顯示,注射后1h有效的腫瘤吸收了23%ID/g,腫瘤血液比值(T/B)的1h后為12,4h達(dá)到120。在所有時間點(diǎn),除腎臟外,腫瘤攝取比所有其他器官的攝取高??焖俳档脱褐械姆派湫苑e累,在尿液中顯示快速清除,其主要由腎小球濾過。111In - ABY-002的快速動力學(xué)允許HER-2過度表達(dá)的腫瘤在注射后1h可視化。 雙標(biāo)記實(shí)驗,即在小鼠異種移植模型中共注射68Ga-和親和體分子與兩個不同的放射性金屬標(biāo)記,一是伽馬發(fā)射器和一個正電子發(fā)射體。結(jié)果顯示相似的腫瘤同時攝取兩種分子。然而,68Ga-ABY-002在血液、肺、脾的放射強(qiáng)度比111In- ABY-002 顯著低。因此,圖像的對比度是68Ga-ABY-002 PET圖像比111In - ABY-002略勝一籌。近日,HER-2靶向親和體被連接到超順磁性氧化鐵顆粒對腫瘤進(jìn)行靶向造影,結(jié)果在腫瘤部位可見帶有親和體親和性的超順磁性氧化鐵顆粒信號。實(shí)驗證明,親和體分子可以帶有大量的各種放射性核素,因此親和體用做SPECT或PET示蹤劑是可能的[10]。

    2.在靶向治療的應(yīng)用:親和體分子在影像學(xué)中的應(yīng)用,其實(shí)是通過將放射性核素作為它的有效負(fù)載來實(shí)現(xiàn)的,如果選用治療腫瘤的藥物替代放射性核素來充當(dāng)親和體分子的負(fù)載,那么通過連接親和體分子和抗腫瘤藥物,或者載有抗腫瘤藥物的給藥系統(tǒng),就可實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療。目前親和體分子在藥物載體方面的應(yīng)用大多是將親和體分子連接到納米粒表面,納米粒是由高分子材料制備的具有“核-殼結(jié)構(gòu)”的材料,通過親和體的特異性和親和性,使納米粒達(dá)到靶向的功能[11]。Alexis 等[12]將親和體分子Cys-ZHER-2:342偶聯(lián)到納米粒表面,制備了靶向納米粒,同時設(shè)置非靶向納米粒為對照,用SKBR-3 和SKOV-3 兩個細(xì)胞系來評估它們的外攝取和細(xì)胞毒性,結(jié)果顯示兩種細(xì)胞系中靶向納米粒組的細(xì)胞攝取率和殺傷活性均優(yōu)于非靶向納米粒組,說明其制備的靶向納米粒具有應(yīng)用前景。

    也有研究者通過基因重組技術(shù)將毒素的編碼基因與親和體分子進(jìn)行克隆融合重組,經(jīng)在體外細(xì)菌中表達(dá)、純化, 制備出免疫毒素,以親和體作為導(dǎo)向分子, 將毒素靶向癌細(xì)胞, 達(dá)到治療的目的。最新研究表明,Zielinski等[13]在HER-2的高特異性高親和體分子上融合免疫毒性蛋白PE38,制備了HER-2的高親和的毒性分子親和體,按照0.25mg/kg的劑量尾靜脈注射于接種了HER-2高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的腫瘤模型裸鼠,連續(xù)注射6次,30天后腫瘤消失。于脂質(zhì)體雙層插入HER-2特異性的親和體分子也可靶向殺傷HER-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞,從而提高治療效果和安全效果。這些為腫瘤的治療提供了更為有效的新的治療手段。

    3.在生物技術(shù)中的應(yīng)用:由于親和體分子具有和抗體相似的親和性,而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,分子質(zhì)量小,故已被廣泛地用于抗體的生物分離,如親和層析、免疫沉淀等生物技術(shù)。目前, 親和體 AB公司與GE Healthcare公司一起研制親和體的改進(jìn)方式,如堿穩(wěn)定版本,為耐受性提高到堿處理再生在親和層析中。近來有研究表明,親和體分子在酶聯(lián)免疫吸附測定和免疫組化的應(yīng)用中也取得了相應(yīng)的進(jìn)展。Friedman 等[14]還用親和體分子作為熒光探針檢測細(xì)胞表面EGFR 和HER-2 受體的表達(dá)水平。有關(guān)ELISA設(shè)置中,親和體分子作為親和探針固定在蛋白質(zhì)微陣列。例如,在一項研究中將二聚體的親和體分子與IgA抗體,IgE抗體,IgG抗體,腫瘤壞死因子,胰島素和Taq聚合酶親和體,分別固定在硫醇葡聚糖微陣列載玻片,隨后孵化與熒光標(biāo)記的分析物,露出各自靶蛋白的特異性結(jié)合,而且沒有觀察到交叉反應(yīng)。

    總之,親和體分子代表了一類新的親和性配體,由于其具有分子質(zhì)量小、結(jié)合力高、特異性強(qiáng)、靶向濃聚迅速、血液清除快等優(yōu)點(diǎn),在過去的20年中,在成像、靶向治療和生物技術(shù)等方面得到了廣泛研究。目前已經(jīng)成功地用親和體分子診斷HER-2表達(dá)陽性的癌癥患者,而且也有將親和體分子作為IgG親和純化柱的親和配體,商業(yè)化后年銷售額達(dá)數(shù)千萬元。目前親和體分子的應(yīng)用領(lǐng)域日益廣泛,隨著更多親和體的開發(fā),親和體有望替代抗體,完成目標(biāo)蛋白檢測、分離、腫瘤影像診斷及治療等作用。

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    (修回日期:2015-02-26)

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81172463);溫州市科技局基金資助項目(Y20140319)

    325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(王樂丹); 325000 溫州醫(yī)科大學(xué)(張麗芳)

    張麗芳,教授,博士生導(dǎo)師,電子信箱:zlf@wzmc.net

    R392

    A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.005

    2015-01-14)

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