線粒體功能學(xué)研究常用實驗方法

劉江濤，王霖霖(綜述)，郭 雄，龐清江(審校)

(1.寧波市第二醫(yī)院骨科中心，浙江寧波315010;2.寧波市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江寧波315010;3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨病研究所，西安710061)

線粒體是一種存在于大多數(shù)真核細胞中的雙層膜細胞器。線粒體具有自身的遺傳系統(tǒng)，但其基因組大小有限，且受核基因組的調(diào)控，所以是一種半自主的細胞器[1]。線粒體產(chǎn)生ATP為細胞供能，并在細胞中間代謝產(chǎn)物的氧化、細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)等細胞活動中發(fā)揮著重要作用[2]。線粒體是細胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的場所，同時本身也是氧自由基攻擊的靶目標[3]。線粒體功能障礙可引起細胞內(nèi)多種信號級聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，并啟動程序性細胞死亡，其在幾乎所有疾病的發(fā)生、發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[4]。線粒體作為細胞病變或損傷時最敏感的指標之一，對其功能的研究是分子細胞病理學(xué)檢查的重要內(nèi)容[5]?，F(xiàn)就線粒體功能學(xué)研究常用實驗方法綜述如下。

1 線粒體的提取

蔗糖密度梯度離心法是提取線粒體的經(jīng)典方法[6]，其根據(jù)細胞各組分密度的不同，將細胞或組織勻漿液懸浮于均勻的懸浮介質(zhì)中，采用差速離心的方法進行分離。緩沖的蔗糖溶液(0.25 mol/L蔗糖)比較接近細胞質(zhì)的分散相，可在一定程度上保持各種細胞器的結(jié)構(gòu)以及酶的活性，成為最常應(yīng)用的懸浮介質(zhì)。此外，在pH值=7.2的條件下，各亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。

蔗糖密度梯度離心法的一般步驟是先將細胞或組織制成勻漿，然后利用差速離心法在均勻的懸浮介質(zhì)中分離，其過程主要包括組織細胞勻漿、分級分離及分析3步。目前這種方法已經(jīng)成為研究亞細胞成分的化學(xué)組成、理化性質(zhì)及其功能的主要手段。勻漿:在低溫條件下，將細胞或組織放到加入等滲勻漿介質(zhì)的勻漿器中進行破碎，使之成為由各種細胞器及其包含物所組成的勻漿。分級分離:由低速到高速逐級離心沉降，先用低速沉淀較大的顆粒，再用較高的轉(zhuǎn)速沉淀浮在上清液中的顆粒，從而使細胞核、線粒體等各種亞細胞結(jié)構(gòu)得以分離。由于樣品中各密度和大小不同的顆粒在離心開始時均勻地分布在離心管中，所以每級離心第1次得到的沉淀必然不是純的最重的顆粒，還須反復(fù)懸浮、離心加以純化。分析:利用細胞化學(xué)和生化方法對分級分離得到的組分進行形態(tài)和功能鑒定，常用的是詹納斯綠活染法。

為保證獲得完整的線粒體，必須做到:①全程低溫操作，將樣品管放在冰水浴而不是碎冰塊中;②快速，微量制備操作更方便和快速，因而比大規(guī)模制備更易獲得完整的線粒體;③充分破碎細胞但不破壞亞細胞器是制備線粒體最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細胞(特別是貼壁細胞)用普通玻璃勻漿器勻漿時較難破壁，因而要選用小容量且間隙嚴密的玻璃勻漿器，研杵上下充分研磨培養(yǎng)細胞。在相差顯微鏡下檢查見未裂解細胞在30%～50%即可，過度研磨會破壞線粒體結(jié)構(gòu)，研磨不足則會降低獲得率。

此外，線粒體分離提取試劑盒可以快速、簡單地從組織或細胞中分離出粗制線粒體。試劑盒提取的粗制線粒體可直接用于線粒體的研究，如線粒體結(jié)構(gòu)分析、功能研究及線粒體相關(guān)的凋亡研究等，并可用于制備純化線粒體及亞線粒體[7]。

2 線粒體耗氧量檢測

常用氧電極極譜法檢測線粒體的耗氧量[8]。線粒體耗氧量可分為內(nèi)源性耗氧量和呼吸鏈復(fù)合體耗氧量。內(nèi)源性耗氧量是指完整細胞在單位時間內(nèi)的耗氧量，反映了完整細胞整個的氧化磷酸化能力;呼吸鏈復(fù)合體耗氧量是指洋地黃皂苷預(yù)處理的細胞，在加入特定的呼吸鏈復(fù)合體底物時單位時間的耗氧量，反映的是特定線粒體呼吸鏈復(fù)合體的氧化磷酸化能力。洋地黃皂苷能結(jié)合真核細胞膜上的膽固醇，在細胞膜上形成孔狀結(jié)構(gòu)，使細胞膜的通透性增高，細胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)釋放到細胞質(zhì)外。亞細胞(如線粒體)膜結(jié)構(gòu)上膽固醇的水平非常低，因而不會造成通透性增高。因此，洋地黃皂苷處理的細胞完整地保存了細胞內(nèi)細胞器及細胞骨架的結(jié)構(gòu)，當加入特定的呼吸鏈底物或抑制劑時，可準確地反映特定線粒體呼吸鏈復(fù)合體的氧化磷酸化能力。常用的復(fù)合物Ⅰ底物為谷氨酸和蘋果酸，抑制劑為魚藤酮;復(fù)合物Ⅱ+Ⅲ底物為甘油-3-磷酸和琥珀酸，抑制劑為抗霉素;復(fù)合物Ⅳ底物為抗壞血酸和N，N，N'，N'-四甲基對苯二胺，抑制劑為氰化鉀。

3 線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性檢測

常用分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅴ的活性[9]。樣品一般選擇分離純化的線粒體，每個呼吸鏈復(fù)合體檢測需要4～40 μg線粒體蛋白。為了比較不同細胞或組織中線粒體呼吸鏈復(fù)合體的活性，需同時檢測三羧酸循環(huán)中的枸櫞酸合酶的活性作為對照。反應(yīng)體系在30℃進行，反應(yīng)體積為200 μL 或1 mL。

復(fù)合物Ⅰ活性檢測的基本原理:由于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide-reduced，NADH)的氧化，NADH減少，導(dǎo)致在340 nm處NADH的吸光度減少(NADH+H++泛醌1→NAD++泛醌1·H2)。

復(fù)合物Ⅱ活性檢測的原理:由于琥珀酸的氧化，二氯酚靛酚減少，導(dǎo)致在600 nm處二氯酚靛酚的吸光度減少(琥珀酸+泛醌1→延胡索酸+泛醌1·H2;泛醌1·H2+二氯酚靛酚→泛醌1+二氯酚靛酚·H2)。

復(fù)合物Ⅲ活性檢測的基本原理:由于氧化型細胞色素C的還原，還原型細胞色素C增加，導(dǎo)致在550 nm處還原型細胞色素C的吸光度增加(癸基泛醌·H2+氧化型細胞色素C→癸基泛醌+還原型細胞色素C)。

復(fù)合物Ⅳ活性檢測的基本原理:由于還原型細胞色素C的氧化，還原型細胞色素C減少，導(dǎo)致在550 nm還原型細胞色素C的吸光度減少(還原型細胞色素C+O2→氧化型細胞色素C+H2O)。

復(fù)合體Ⅴ活性檢測的基本原理:由于ATP酶水解ATP，NADH減少，導(dǎo)致在340 nm處NADH的吸光度減少(鎂·ATP→鎂·ADP+磷酸;鎂·ADP+磷酸烯醇式丙酮酸→鎂·ATP+丙酮酸;丙酮酸+NADH+H+→乳酸+NAD+)。

枸櫞酸合酶活性檢測的基本原理:由于5-硫-2-硝基苯甲酸根的形成，導(dǎo)致在412 nm處5-硫-2-硝基苯甲酸根的吸光度增加[草酰乙酸+乙酰輔酶A→枸櫞酸+輔酶A;輔酶A+5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)→輔酶A·硫代硝基苯甲酸+5-硫-2-硝基苯甲酸根]。

4 線粒體膜電位的檢測

線粒體在電子傳遞鏈中將H+從基質(zhì)泵至膜間隙，形成跨線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的線粒體膜電位。線粒體膜電位的維持是線粒體正常功能實現(xiàn)的必要條件，膜電位下降會導(dǎo)致線粒體ATP生成不足，進而影響細胞的正常生命活動，其是細胞凋亡過程中最早發(fā)生的事件之一[10]。膜電位的降低標志著細胞線粒體膜結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列改變:膜間通透性轉(zhuǎn)換孔道開放，線粒體內(nèi)膜通透性增高，內(nèi)膜H+梯度平衡失常甚至消失，此時，許多親脂性的陽離子化合物能夠結(jié)合到線粒體內(nèi)膜，可以利用流式細胞儀、熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體的形態(tài)變化。

羅丹明123是最早發(fā)現(xiàn)的線粒體染色劑，其可特異性地被活細胞線粒體攝取，攝取率與線粒體膜電位呈正比，反映了線粒體膜電位的高低，其具有較好的靈敏性，可使用流式細胞儀或熒光分光光度計檢測熒光值的變化[11]。

四氯四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(5，5'，6，6'-tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethylben-zimidazole carbocyanide iodide，JC-1)是比羅丹明123更為敏感的熒光探針，它可以檢測組織、細胞或純化的線粒體的膜電位[12]。當線粒體膜電位較低時，JC-1以單體的形式存在，產(chǎn)生綠色熒光;當線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光?；谶@種電壓依賴性的顏色轉(zhuǎn)變，JC-1是一個很好的電壓依賴性熒光染料，可利用熒光顯微鏡或流式細胞儀對線粒體做定性和定量的分析。

此外，四甲基羅丹明甲酯也是一種應(yīng)用較多的陽離子熒光染料，單激光激發(fā)和單熒光發(fā)射峰可用540 nm激光激發(fā)，橙紅色熒光波長在620 nm左右[13]。相對其他熒光探針，四甲基羅丹明甲酯的主要優(yōu)點是染料在線粒體的積累僅源于膜電位變化，其與細胞器結(jié)合率低，適合做線粒體膜電位的定量分析，其相對毒性更小[14]。

5 ATP水平檢測

線粒體最重要的一個功能就是為細胞各項生命活動生成所需的ATP，因此檢測細胞內(nèi)ATP水平變化可直觀地反映線粒體的功能狀態(tài)。通常ATP水平的降低提示線粒體功能受損。在細胞凋亡時，ATP水平的下降通常伴隨線粒體膜電位的降低[15]。ATP的檢測可以用成色反應(yīng)、熒光、發(fā)光或同位素等方法實現(xiàn)。采用發(fā)光法檢測ATP具有更高的敏感性，而且簡便、快速，是目前最為流行的方法[16]。該方法是基于螢火蟲熒光素酶催化熒光素氧化，消耗ATP，從而發(fā)出光子的高效發(fā)光反應(yīng)，具有發(fā)光效率極高、發(fā)光量與ATP水平呈線性關(guān)系的優(yōu)點。ATP是螢光素氧化反應(yīng)中的限制因素，光的強度與樣品中的ATP水平相關(guān)。

6 線粒體離子通道檢測

線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔是一種橫跨在線粒體內(nèi)外膜間的非選擇性高導(dǎo)電性通道，通常為關(guān)閉狀態(tài)，是線粒體滲透轉(zhuǎn)換功能的基礎(chǔ)。線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔對細胞內(nèi)外多種離子水平的變化非常敏感。鈣超載或活性氧類生成等均可誘發(fā)線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔開啟[17]。線粒體大量滲透轉(zhuǎn)換孔的開啟可引起膜電位降低甚至崩解，導(dǎo)致線粒體功能損傷、氧化應(yīng)激以及細胞凋亡。常用的線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔檢測方法有分光光度法、活性物質(zhì)標記法及膜片鉗法等，其中分光光度法因簡單和方便而獲得較多應(yīng)用。

7 活性氧類水平檢測

在生物體內(nèi)，正常生理條件下線粒體能消耗90%以上氧分子產(chǎn)生的能量，約2%的氧分子由于不能被完全還原而與線粒體呼吸鏈電子漏發(fā)生反應(yīng)，生成超氧陰離子自由基[18]。細胞及線粒體基質(zhì)中有著完善的抗氧化體系，包括過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽系統(tǒng)及硫氧還蛋白系統(tǒng)等。正常情況下，細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于一種平衡狀態(tài)，細胞內(nèi)活性氧類水平維持在一個比較低的生理范圍;在病理情況下，細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細胞內(nèi)活性氧類水平過多，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，并通過各種途徑釋放細胞色素C，從而誘導(dǎo)細胞凋亡，影響組織和器官的功能[19]。因此，通過檢測細胞內(nèi)或線粒體活性氧類的水平，以及各種氧化防御體系酶的活性，可反映線粒體的功能狀態(tài)。細胞內(nèi)或線粒體活性氧類的水平可采用試劑盒直接檢測;超氧化物歧化酶的活性可通過鄰苯三酚自氧化法測定;谷胱甘肽系統(tǒng)是細胞內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，其在細胞抵抗活性氧類中起重要作用，谷胱甘肽的水平可通過5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)法測定;丙二醛的水平反映了機體脂質(zhì)過氧化的程度，可通過硫代巴比妥酸比色法測定[20]。

8 免疫蛋白印跡

免疫蛋白印跡常用的有十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和藍色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(blue native polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE)，此外還有蛋白分離功能更強的雙向電泳。

SDS-PAGE是最常用的蛋白質(zhì)分離鑒定方法。十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)為陰離子表面活性劑，其能夠破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶有更多的負電荷，因而掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異，導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電泳時的遷移率只與蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量有關(guān)，而不再受原有電荷和分子形狀的影響。

BN-PAGE常用于線粒體呼吸鏈復(fù)合體、膜蛋白及同工酶的鑒定和提純，其是在不加入巰基乙醇、SDS等變性劑的條件下，對保持蛋白質(zhì)活性的樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。未加入 SDS等變性劑的天然PAGE能夠使生物大分子在電泳過程中保持天然的形狀和電荷，它們分離的依據(jù)是電泳遷移率和凝膠的分子篩作用，因而可以得到比較高的分離效率。電泳分離完成后仍能保持蛋白和酶等生物大分子的活性，因而對后續(xù)鑒定有重要的意義[21]。

雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)，隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，現(xiàn)已能分離出10000個斑點。其原理簡明:第一向是進行等電聚焦，蛋白質(zhì)會沿pH梯度分離，直至各自的等電點;第二向是再沿垂直方向進行分子量的分離;最后經(jīng)染色得到的電泳圖是一個二維分布的蛋白質(zhì)圖。在線粒體研究中，雙向電泳常被用來分離第一向BN-PAGE得到的線粒體呼吸鏈復(fù)合物，因而對于線粒體呼吸鏈復(fù)合物的鑒定有重要意義[22]。

9 線粒體DNA拷貝數(shù)

線粒體具有自己的基因組。一般來講，每個線粒體具有數(shù)以百計的線粒體DNA拷貝數(shù)，線粒體DNA拷貝數(shù)的改變會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。常用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測線粒體DNA拷貝數(shù)的變化。結(jié)合兩個單獨的實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，對待測樣本中線粒體DNA和核基因分別進行定量檢測，然后以核基因作為對照，對線粒體DNA拷貝數(shù)進行相對定量[23]。

10 小結(jié)與展望

線粒體功能受線粒體基因組和核基因組的雙重調(diào)控，對其準確檢測需要聯(lián)合使用多種實驗方法或生物技術(shù)。除上述常用方法外，可借助電子顯微鏡對線粒體形態(tài)學(xué)變化進行研究;線粒體代謝物活力可檢測乳酸、丙酮酸、乳酸脫氫酶等水平;線粒體DNA損傷可利用DNA測序技術(shù)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、限制性片段長度多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性、DNA芯片技術(shù)及高效液相色譜技術(shù)等檢測。

雖然現(xiàn)在有很多方法可用來檢測線粒體的功能，但是由于實驗方法的局限性、所涉及儀器的運行成本及工作人員操作技能等限制，目前大多數(shù)方法仍局限于科研。隨著實驗診斷技術(shù)的發(fā)展，更加可靠的綜合性全基因組分子診斷策略將會逐步建立和完善，這些線粒體功能學(xué)研究方法也終將應(yīng)用于臨床。

[1]Reginald HG，Charles MG.Biochemistry[M].4 th ed.USA:Brooks Cole，2008:623.

[2]Piantadosi CA，Suliman HB.Redox regulation of mitochondrial biogenesis[J].Free Radic Biol Med，2012，53(11):2043-2053.

[3]Rigoulet M，Yoboue ED，Devin A.Mitochondrial ROS generation and its regulation:mechanisms involved in H2O2signaling[J].Antioxid Redox Signal，2011，14(3):459-468.

[4]Brand MD，Nicholls DG.Assessing mitochondrial dysfunction in cells[J].Biochem J，2011，435(2):297-312.

[5]Duchen MR，Szabadkai G.Roles of mitochondria in human disease[J].Essays Biochem，2010，47:115-137.

[6]Chomyn A.In vivo labeling and analysis of human mitochondrial translation products[J].Methods Enzymol，1996，264:197-211.

[7]Zhang Q，Raoof M，Chen Y，et al.Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury [J].Nature，2010，464(7285):104-107.

[8]Hofhaus G，Shakeley RM，Attardi G.Use of polarography to detect respiration defects in cell cultures[J].Methods Enzymol，1996，264:476-483.

[9]Barrientos A，F(xiàn)ontanesi F，Díaz F.Evaluation of the mitochondrial respiratory chain and oxidative phosphorylation system using polarography and spectrophotometric enzyme assays[J].Curr Protoc Hum Genet，2009，19(3):1-14.

[10]Orrenius S.Mitochondrial regulation of apoptotic cell death [J].Toxicol Lett，2004，149(1/3):19-23.

[11]Forster S，Thumser AE，Hood SR，et al.Characterization of Rhodamine-123 as a tracer dye for use in invitro drug transport assays[J].PloS One，2012，7(3):e33253.

[12]Salvioli S，Adrdizzoni A，F(xiàn)rancheschi C，et al.JC-1，but not DiOC6(3)or rhodamine 123，is a reliable fluorescent probe to assess membrane potential changes in intact cells:implications for studies on mitochondrial function during apoptosis[J].FEBS Lett，1997，411(1):77-82.

[13]Chazotte B.Labeling mitochondria with MitoTracker dyes[J].Cold Spring Harb Protoc，2011，2011(8):990-992.

[14]Giorgioa V，Petronillia V，Ghellib A，et al.The effects of idebenone on mitochondrial bioenergetics[J].Biochim Biophys Acta，2012，1817(2):363-369.

[15]Qu Y，Misaghi S，Newton K，et al.Pannexin-1 is required for ATP release during apoptosis but not for inflammasome activation[J].J Immunol，2011，186(11):6553-6561.

[16]Li YF，Park JS，Deng JH，et al.Cytochrome c oxidase subunit iv is essential for assembly and respiratory function of the enzyme complex[J].J Bioenerg Biomembr，2006，38(5/6):283-291.

[17]Gellerich FN，Gizatullina Z，Trumbeckaite S，et al.The regulation of OXPHOS by extramitochondrial calcium[J].Biochim Biophys Acta，2010，1797(6/7):1018-1027.

[18]Taylor CT.Mitochondria and cellular oxygen sensing in the HIF pathway[J].Biochem J，2008，409(1):19-26.

[19]Norberg E，Gogvadze V，Vakifahmetoglu H，et al.Oxidative modification sensitizes mitochondrial apoptosis-inducing factor to calpainmediated processing[J].Free Radic Biol Med，2010，48(6):791-797.

[20]Cali T，Ottolini D，Brini M.Mitochondria，calcium，and endoplasmic reticulum stress in Parkinson's disease[J].Biofactors，2011，37(3):228-240.

[21]Wittig I，Braun HP，Sch?gger H.Blue native PAGE[J].Nat Protoc，2006，1(1):418-428.

[22]Rabilloud T，Chevallet M，Luche S，et al.Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics:Past，present and future[J].J Proteomics，2010，73(11):2064-2077.

[23]Castle JC，Biery M，Bouzek H，et al.DNA copy number，including telomeres and mitochondria，assayed using next-generation sequencing[J].BMC Genomics，2010，11:44.