禽坦布蘇病毒分子生物學(xué)診斷方法研

于新友 李天芝 王 艷

(1山東綠都生物科技有限公司 山東濱州 256600 2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東濱州 256600)

禽坦布蘇病毒（Avian Tembusu virus，ATMUV）可感染鴨、鵝和雞等多種禽類，引起禽坦布蘇病毒病[1]（Avian Tembusu virus disease，ATMUVD），該病自2010年在我國(guó)暴發(fā)以來(lái)，迅速波及到全國(guó)多個(gè)省份[2]，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。禽坦布蘇病毒為黃病毒科、黃病毒屬成員，引起鴨發(fā)病的病毒又稱為鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）。感染鴨群的發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率在5%～15%，臨床表現(xiàn)為高熱、蛋鴨產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降、部分感染鴨拉綠色稀便并出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。病理剖檢主要表現(xiàn)為卵巢充血、出血、萎縮和壞死，卵泡破裂，心內(nèi)膜出血，脾臟腫大。該病造成約1.2億只蛋鴨和1 500萬(wàn)只肉鴨感染發(fā)病，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元[4]。本文就近年來(lái)禽坦布蘇病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要概述，以期為該病的快速診斷和防控提供參考。

1 核酸探針

核酸探針技術(shù)是常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，它具有操作簡(jiǎn)單，不受抗原抗體反應(yīng)的限制，結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層推廣使用。高緒慧等[5]根據(jù)GenBank中Bagaza株MDTUV基因組序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增NS3基因406bp的特異性片段，將純化的PCR產(chǎn)物用地高辛進(jìn)行探針標(biāo)記，建立了地高辛標(biāo)記探針檢測(cè)MDTUV的方法。該法敏感性高，最低檢出限量為100pg/L，特異性好，不與鴨瘟病毒、H9N2亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒和減蛋綜合征病毒的核酸發(fā)生雜交反應(yīng)。

2 RT-PCR方法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)病毒的方法，以其簡(jiǎn)便、迅速及靈敏等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。張帥等[6]建立了DTMUV的一步法RT-PCR檢測(cè)方法，該法具有特異、快速、敏感及準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以檢出1.82個(gè)TCID50的病毒的核酸。李國(guó)平[7]根據(jù)GenBank上登錄的DTMUV基因組序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，建立了檢測(cè)DTMUV的RT-PCR診斷方法，該法對(duì)Ⅰ型鴨肝炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒和鴨腸炎病毒等常見(jiàn)鴨病的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，檢測(cè)的敏感性達(dá)1ng RNA。張艷芳等[8]根據(jù)GenBank中DTMUV E基因和鴨圓環(huán)病毒REP基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物，建立了鴨坦布蘇病毒和鴨圓環(huán)病毒的二重RT-PCR方法。結(jié)果表明:該方法對(duì)鴨坦布蘇病毒和鴨圓環(huán)病毒的檢測(cè)敏感性達(dá)到100fg，對(duì)新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒、番鴨呼腸孤病毒、H9亞型禽流感病毒和減蛋綜合征病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。趙虹等[9]針對(duì)GenBank中DTMUV NS2基因、所有亞型AIV M 基因和H9亞型AIVHA基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，建立可同時(shí)快速檢測(cè)DTMUV、所有亞型AIV和H9亞型AIV分型檢測(cè)的多重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)其他鴨病病原體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性，敏感性測(cè)定結(jié)果顯示，該方法能檢測(cè)到45pg的DTMUV，7.6pg的H9亞型AIV和76pg的AIVM基因。孫敏華等[10]建立了可同時(shí)檢測(cè)DTMUV和EDSV 2種病毒的二重PCR檢測(cè)方法，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該法可以同時(shí)檢測(cè)DTMUV和EDSV，且不與鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、番鴨呼腸孤病毒、小鵝瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒及大腸桿菌的核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，敏感性試驗(yàn)表明，該法對(duì)DTMUV的最低檢出限為590個(gè)拷貝，對(duì)EDSV的最低檢出限為3 260個(gè)拷貝，該方法重復(fù)性良好，對(duì)不同批次的樣品擴(kuò)增效果良好。

3 套式PCR方法

套式PCR，又稱巢式PCR。使用2對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的片段，以第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)的特異性更好，敏感性也更高。顏丕熙等[11]根據(jù)DTMUV E基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)重疊引物P1、P2和P3、P4，建立了檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的套式RT-PCR方法，該套式RT-PCR比一般PCR敏感性高10倍。采用該方法對(duì)安徽省、河北省、山東省、浙江省和上海市等地發(fā)病鴨場(chǎng)的63份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為48/63（76.2%），而病毒分離率僅為13/63（20.6%）。黃欣梅等[12]根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝黃病毒JS804株全基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，建立了禽黃病毒套式RT-PCR檢測(cè)方法，該法最低病毒檢測(cè)量為101.89 TCID50/0.1mL，比普通RT-PCR方法敏感性高1 000倍。

4 熒光定量RT-PCR方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快和全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。Yan等[13]針對(duì)DTMUV E基因設(shè)計(jì)引物，建立了DTMUV TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法，該法比常規(guī)RT-PCR敏感100倍，最低可檢測(cè)到50個(gè)拷貝的病毒核酸。Yun等[14]針對(duì)ATMUV 3′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)MGB探針，建立了檢測(cè)ATMUV的熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)時(shí)間短，2h內(nèi)即可完成檢測(cè)。萬(wàn)春和等[15]根據(jù)DTMUVNS5基因序列特征設(shè)計(jì)引物，建立基于SYBRGreenⅠ檢測(cè)模式的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，該方法檢測(cè)DFV NS5基因2.74×103-2.74×107拷貝/μL，反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析只出現(xiàn)1個(gè)單特異峰，無(wú)引物二聚體，Tm值為(86.23±0.18)℃，對(duì)禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨源禽Ⅰ型副黏病毒、鴨減蛋綜合征病毒和番鴨呼腸孤病毒核酸均無(wú)陽(yáng)性信號(hào)擴(kuò)增，可重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)為0.52%～1.48%，組間變異系數(shù)0.71%～2.21%。彭珊等[16]建立了DTMUV的TagMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，該法檢測(cè)敏感性是普通PCR方法的100倍，并且該方法對(duì)DTMUV的最低檢側(cè)限是0.01半數(shù)雞胚致死量(ELD50)。通過(guò)批內(nèi)和批間實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)表明優(yōu)化的熒光定量PCR方法的重復(fù)性比未優(yōu)化的熒光定量PCR方法好，該法特異性好，對(duì)其他鴨病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。靳宇田等[17]根據(jù)GenBank已發(fā)表的DTMUV保守基因序列，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物及TaqMan探針，建立了檢測(cè)DTMUV的熒光定量RT-PCR方法，該法特異性好，僅能在DTMUV樣本中檢出熒光信號(hào)，與其他病原不發(fā)生交叉反應(yīng)；敏感性高，質(zhì)粒最低檢測(cè)限可達(dá)25拷貝/μL。張艷芳等[18]根據(jù)GenBank中DTMUV E基因和DPV UL6基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物和2條TaqMan探針，建立了同時(shí)檢測(cè)DTMUV和鴨瘟病毒的二重?zé)晒舛縍T-PCR方法。該法對(duì)DTMUV和鴨瘟病毒的檢測(cè)靈敏度均達(dá)100個(gè)模板拷貝數(shù)，同時(shí)該方法對(duì)鴨源新城疫病毒、鴨肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒、H9亞型禽流感病毒和減蛋綜合征病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。王楠楠等[19]根據(jù)坦布蘇病毒E基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了檢測(cè)坦布蘇病毒的SYBRGreenⅠ絕對(duì)熒光定量RT-PCR方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系顯著(r2＞0.999)，平均試驗(yàn)間變異系數(shù)為0.26%，檢測(cè)敏感性可達(dá)到2×101拷貝/μL。曾婷婷等[20]建立了可鑒別坦布蘇病毒和產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的二重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，該法只擴(kuò)增這2種病毒的目的片段，無(wú)交叉擴(kuò)增反應(yīng)，與其他常見(jiàn)禽類病原體也無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，該檢測(cè)體系最低可同時(shí)檢測(cè)100個(gè)拷貝的坦布蘇病毒和產(chǎn)蛋下降綜合征病毒，比常規(guī)PCR和RT-PCR敏感10～100倍。

5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一項(xiàng)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、高效、敏感、特異和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層應(yīng)用。Wang等建立的可視化檢測(cè)ATMUV的RT-LAMP方法在63℃水浴50min內(nèi)即可完成擴(kuò)增，敏感性達(dá)2拷貝/μL。李兆龍等[21]建立的ATMUV RT-LAMP方法在常規(guī)水浴鍋中45min內(nèi)即可完成，靈敏度達(dá)1 pg，比常規(guī)RT-PCR方法高100倍。RT-LAMP方法本質(zhì)是一種核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法，故具有較高的敏感性與特異性，且該方法簡(jiǎn)便、快速、無(wú)需特殊儀器設(shè)備，特別適合基層獸醫(yī)部門使用，具有廣闊的應(yīng)用前景。董嘉文等[22]根據(jù)DTMUV E基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了1套引物，建立了檢測(cè)DTMUV的RT-LAMP方法，該法的最低檢測(cè)限可達(dá)7.8拷貝，其靈敏度是普通RT-PCR的100倍，對(duì)其他常見(jiàn)鴨源病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。韓凱凱等[23]建立一種基于LAMP技術(shù)的鵝源坦布蘇病毒檢測(cè)方法，該法靈敏度極高，是普通PCR方法的100倍，對(duì)于其他常見(jiàn)禽RNA病毒均無(wú)特異性擴(kuò)增。歐全賓等[24]根據(jù)GenBank發(fā)布的坦布蘇病毒Bagaza毒株E基因的保守序列設(shè)計(jì)1套引物，建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的方法。該法的檢測(cè)敏感性可達(dá)10拷貝/μL，對(duì)鴨坦布蘇病毒山東分離株的檢測(cè)呈陽(yáng)性，而對(duì)鴨瘟病毒、禽流感病毒(H9亞型)、鴨新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒和減蛋綜合征病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

6 競(jìng)爭(zhēng)定量PCR方法

競(jìng)爭(zhēng)定量PCR是先構(gòu)建一個(gè)與靶基因相同的擴(kuò)增效率和引物結(jié)合位點(diǎn)，僅探針結(jié)合位點(diǎn)不同的內(nèi)標(biāo)，在同一反應(yīng)管內(nèi)，靶基因和內(nèi)標(biāo)物和引物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，進(jìn)行同步擴(kuò)增。由于競(jìng)爭(zhēng)作用，當(dāng)一種模板量逐漸增加時(shí)，另一種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)逐漸減少，但2種擴(kuò)增產(chǎn)物的比值和2種初始狀態(tài)時(shí)模板分子數(shù)的比值是一致的。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確含量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而進(jìn)行準(zhǔn)確核酸定量。袁朋等[25]建立了檢測(cè)DTMUV的競(jìng)爭(zhēng)定量PCR方法，該法特異性強(qiáng)、靈敏性高，競(jìng)爭(zhēng)模板和目標(biāo)模板可在400個(gè)分子/μL的水平上共擴(kuò)增，能夠滿足簡(jiǎn)單快速確定病毒含量的要求。

7 小結(jié)與展望

雖然DTMUV分子生物學(xué)鑒別診斷方法有較多，但各有利弊，常規(guī)RT-PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高和檢出率高等特點(diǎn)，但不能準(zhǔn)確地定量、容易污染，且敏感性有限。熒光定量RT-PCR技術(shù)彌補(bǔ)了常規(guī)RT-PCR方法的缺點(diǎn)，但是熒光定量PCR儀器和探針的合成價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本比較高，這也限制了它的普遍應(yīng)用。LAMP方法檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，適合在基層獸醫(yī)和養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行推廣使用，但LAMP方法靈敏度高易導(dǎo)致假陽(yáng)性。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不久的將來(lái)，一些操作簡(jiǎn)單、敏感高、特異性好、檢測(cè)速度快及價(jià)格低廉的DTMUV新型分子生物學(xué)檢測(cè)方法將會(huì)被建立起來(lái)。

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