人類白細(xì)胞相關(guān)抗原G 與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能

張若鵬，王光明，阿周存，朱任堅(jiān)

（大理大學(xué)附屬醫(yī)院 1．生殖醫(yī)學(xué)科；2．病理科；4．婦產(chǎn)科；3．大理大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，云南 大理 671000）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指同一伴侶連續(xù)發(fā)生3 次及3 次以上的自然流產(chǎn)[1]。其發(fā)生率占妊娠的1%～2%，其中40%～60%經(jīng)各種臨床檢查未發(fā)現(xiàn)明確病因稱不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。目前的主要治療方案為免疫治療，但是仍然有20%～40%失敗率。眾多的研究證明HLA-G 的表達(dá)水平與器官移植及妊娠的成功率呈明顯正相關(guān)。絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（extravillouscytotrophoblasts,EVCT）HLA-G 表達(dá)下降、侵襲功能不足與RSA 的發(fā)生密切相關(guān)[2]，而內(nèi)源性HLA-G 表達(dá)強(qiáng)的胚胎妊娠成功率明顯高于表達(dá)相對(duì)較弱的胚胎。采用外源性HLA-G 干預(yù)能否補(bǔ)充RSA 患者胚胎自身HLA-G 抗原表達(dá)不足的缺陷，提高胚胎種植的活力及最終提高妊娠成功率。本研究采用 可 溶 性 HLA-G（solubleHuman Leukocyte Antigen-G，sHLA-G）體外干預(yù)對(duì)RSA 患者滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的影響進(jìn)行了研究。

資料與方法 1．病例及分組：為我院2013年10 月-2014 年3 月于我院行人工流產(chǎn)患者。研究分為正常組及RSA 組。正常組40 例，隨機(jī)選自正常早孕人流患者 孕8 周～10 周，無自然流產(chǎn)史；RSA 組40 例，本次妊娠因保胎失敗而終止妊娠。于人流術(shù)中收集兩組患者絨毛，收集過程中盡量保持無菌，立即置于培養(yǎng)液中快速送往實(shí)驗(yàn)室。RSA 組每例絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞接種3 份，根據(jù)干預(yù)措施不同又分為 RSA 對(duì)照組及研究1 組（RSA＋0.05%終濃度sHLA-G 干預(yù)）、研究2 組（RSA＋0.1%終濃度sHLA-G 干預(yù)）。

2．試劑及儀器：人源性sHLA-G（濃度為1g/L）購于EXBIO 公司，抗人CD146 單克隆抗體購于AbD serotec 公司。流式細(xì)胞儀由美國貝克曼公司提供。

3．滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)：將絨毛組織置于無菌培養(yǎng)皿中，用含100U/ml 青霉素、10%FCS 的DMEM高糖培養(yǎng)液快速、充分洗滌1 次，仔細(xì)剪去膜狀物 將絨毛剪碎約1mm3大小，似糊狀，加入0.25%胰酶15ml 消化混合均勻，置于37℃恒溫箱中消化30min，消化完立即用等體積 15ml 10% FCS DMEM 中和，經(jīng)200 目不銹鋼濾網(wǎng)過濾。將濾液1 000r min（r=14cm）離心10min，所得細(xì)胞團(tuán)在用10% FCS DMEM 洗滌一次后接種于含 10ml 10%FCS DMEM 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，RSA 組患者滋養(yǎng)細(xì)胞每例接種3 瓶，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種24h 更換培養(yǎng)液。正常組及RSA 對(duì)照組：于培養(yǎng)瓶中均加入生理鹽水10μl，研究1 組、研究2 組于培養(yǎng)瓶中分別加入1g/L sHLA-G 5μl、10μl 進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)16h。

4．CD146 檢測(cè)：取懸浮細(xì)胞液1 200r/min 離心10 min 得EVCT 單核細(xì)胞團(tuán)，對(duì)不同干預(yù)組不同的單核細(xì)胞團(tuán)加入8μl CD146 抗體避光10min，加入溶血素1ml 避光5min 去除紅細(xì)胞干擾，用PBS 洗滌一次，最后加入1mL PBS 搖勻上流式檢測(cè)CD146 陽性率。

5．統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。連續(xù)性正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用ANOVA 方差分析，組間比較采用LSD 檢驗(yàn)。

結(jié) 果 1．正常妊娠及RSA 患者EVCT 表達(dá)CD146 表達(dá)正常妊娠組EVCT CD146 陽性率為（68.33±6.21）%，而RSA 對(duì) 照 組 為（9.98±3.20）%，兩者比較差異有極顯著性，P＜0.01。

2．不同濃度sHLA-G 干預(yù)后RSA 患者EVCT CD146 表 達(dá) 變 化0.5μg/ml 及1μg/ml 終 濃 度sHLA-G 干預(yù)EVCT 的CD146 的陽性率分別為（31.20±6.91）%，及（62.22±9.16）%，均顯著高 于RSA 對(duì) 照 組，P均＜0.01；而0.5μg/ml 及1μg/mL兩組之間比較，CD146 陽性率差異亦有顯著意義，1μg/ml 干預(yù)組明顯高于0.5μg/ml 組，P＜0.01。1μg/ml sHLA-G 干預(yù)組與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05。

討 論 HLA-G 屬于非經(jīng)典HLA-I 類基因，位于6 號(hào)染色體短臂，其基因產(chǎn)物分為膜結(jié)合型及可溶性型（sHLA-G）。HLA-G 基因及蛋白呈低度多態(tài)性，個(gè)體間差別不大，主要表達(dá)在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞[3]。CD146 是最近確定的Ig 基因超家族成員，是一種細(xì)胞黏附分子，在絨毛植入及胚胎形成過程中發(fā)揮重要作用。主要表達(dá)在絨毛外層滋養(yǎng)細(xì)胞，在胚胎種植部位侵犯和代替螺旋動(dòng)脈，導(dǎo)致血流通過螺旋動(dòng)脈不受阻礙地進(jìn)入胎盤絨毛間隙，從而建立母體- 胎兒循環(huán)，是反映滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的重要指標(biāo)之一。

已有的研究表明HLA-G 屬于免疫抑制因子，通過多種途徑產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)及保護(hù)作用，形成母胎界面特殊的免疫耐受，其機(jī)制包括：與自然殺傷（NK）細(xì)胞及殺傷性T（Tc）細(xì)胞表面受體結(jié)合，抑制NK 及Tc 細(xì)胞毒效應(yīng)；還可通過介導(dǎo)NK及Tc 細(xì)胞凋亡而有效抑制NK 及Tc 細(xì)胞溶解靶細(xì)胞；調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡，抑制外周血及蛻膜CD4＋T 細(xì)胞分泌IL-2 IFN-r TNF-a 等Th1 型細(xì)胞因子，促進(jìn)IL-4、IL-10 等Th2 型因子分泌。在妊娠頭3個(gè)月，HLA-G 的表達(dá)下降，可使滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕分化過程受阻，滋養(yǎng)細(xì)胞不易侵入子宮蛻膜及重鑄螺旋動(dòng)脈，絨毛著床過淺，血管發(fā)育欠佳，不能有效供應(yīng)胎盤營養(yǎng)，使胎盤生長發(fā)育受限，導(dǎo)致胎兒生長受限、自然流產(chǎn)。本研究顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞CD146 表達(dá)明顯低于正常妊娠組，提示滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力下降是RSA 發(fā)生的病理生理機(jī)制之一[4]。

外源性sHLA-G 干預(yù)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的影響。采用外源性sHLA-G 干預(yù) 可補(bǔ)充RSA 患者HLA-G表達(dá)不足，發(fā)揮HLA-G 對(duì)妊娠的保護(hù)作用，有利于滋養(yǎng)細(xì)胞及胚胎的正常發(fā)育。本研究顯示補(bǔ)充外源性sHLA-G 后，RSA 患者的滋養(yǎng)細(xì)胞CD146表達(dá)明顯升高，且其表達(dá)強(qiáng)度與培養(yǎng)液中HLA-G的濃度呈正相關(guān)。0.5μg/ml 干預(yù)組，CD146 的表達(dá)率較生理鹽水組明顯升高，當(dāng)培養(yǎng)液中濃度達(dá)到1μg/ml 時(shí)則已接近正常妊娠HLA-G 誘導(dǎo)宿主免疫耐受不僅在母胎免疫平衡中得到證實(shí)而且在其他研究中亦得到充分證明。

［1］謝幸，茍文麗．婦產(chǎn)科學(xué)[M]．第8 版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013，49.

［2］張銘艷，曾杰，胡吉英，等．HLA-G 蛋白在原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)中的表達(dá)[J]．中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19（1）：28-31．

［3］BERGER DS,HOGGE WA,BARMADA MM,et al.Comprehensive analysis of HLA-G implications for recurrent spontaneous abortion[J]．Reprod Sci,2010,17(4)：331-338．

［4］KOTZE DJ,HANSEN P,KESKINTEPE L,et al．Embryo selection criteria based on morphology versus the expression of a biochemical marker sHLA-G and agraduated embryo score prediction of pregnancy outcome[J]．J Assist Reprod Genet,2010,27(6)：309-316．