dnaK操縱子研究進(jìn)展

戴 瑩，劉金鳳，牛雪薇 綜述;張志民 審校

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，吉林長春130000)

DnaK是熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)的重要分子伴侶，對許多G+菌在應(yīng)激環(huán)境下的耐受以及蛋白質(zhì)的折疊、翻譯、合成和分解都有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，dnaK操縱子是參與編碼與熱休克反應(yīng)相關(guān)的保守蛋白質(zhì)，且在進(jìn)化過程中會發(fā)生改變［1］。dnaK 操縱子由 hrcA、grpE、dnaK、dnaJ基因組成，其中DnaK和DnaJ都被用于構(gòu)建各種生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。通過利用與grpE的氨基酸序列同源性得到一個G+菌基于部分蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹，該結(jié)果與從5S rRNA、16S rRNA、dnaK和dnaJ序列基因產(chǎn)生的進(jìn)化樹相比得出3種群集:由芽孢桿菌屬和金黃色葡萄球菌組成的低GMC DNA的G+菌(鏈球菌/乳酸乳球菌/腸球菌/清酒乳桿菌)，以及由分支桿菌和天藍(lán)色鏈霉菌屬高GMC DNA的G+菌組成的第3群集［2］。下面就己發(fā)現(xiàn)的danK操縱子的基因及其結(jié)構(gòu)、可能的作用機(jī)制、功能以及研究意義等方面作一綜述。

1 danK操縱子的基因結(jié)構(gòu)

dnaK 操縱子由 hrcA、grpE、dnaK、dnaJ 4個結(jié)構(gòu)基因組成，hrcA-grpE-dnaK-dna是 G+菌中dnaK操縱子的最基本也是最常見的結(jié)構(gòu)，例如枯草芽孢桿菌［3］、金黃色葡萄球菌［4］和丙酮丁醇梭菌［4-5］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在枯草芽孢桿菌中有3個額外基因被轉(zhuǎn)錄［6］，變異鏈球菌dnaK操縱子的長度與枯草芽孢桿菌相似［7］?？寺》治鍪塞}四聯(lián)球菌JCM5888的dnaK操縱子的結(jié)果表明，該操縱子同樣由4個開放閱讀框hrcA-grpE-dnaK-dnaJ組成;清酒乳桿菌LTH681的dnaK操縱子基因結(jié)構(gòu)也由 hrcA-grpE-dnaK-dnaJ組成［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，在一些G+菌中dnaK操縱子結(jié)構(gòu)基因的組成存在一定差異。利用巨大芽孢桿菌的dnaK操縱子的內(nèi)部片段作為探針進(jìn)行測序顯示，在序列orf39-grpE-dnaK-dnaJ中有4個開放閱讀框架，但開放閱讀框Orf39所編碼的多肽生物學(xué)功能未知，與數(shù)據(jù)庫中的蛋白也無顯著同源性［8］。Eaton［9］、Van Asseldonk［10］等報道，乳酸乳球菌的dnaK操縱子結(jié)構(gòu)基因不包括dnaJ基因［9-10］，枯草芽孢桿菌的dnaK操縱子為七順反子結(jié)構(gòu)，包含3個附加的熱休克基因均位于dnaJ基因的下游;而金黃色葡萄球菌和丙酮丁醇梭菌有1個下游基因。

在hrcA起始密碼子的上游有一個高度保守的反向重復(fù)序列，稱為CIRCE元件。此元件與dnaK操縱子的調(diào)控及轉(zhuǎn)錄機(jī)制密切相關(guān)。

2 danK操縱子的作用機(jī)制

dnaK操縱子的調(diào)控機(jī)制與CIRCE元件息息相關(guān)，通過HrcA蛋白與CIRCE元件相互作用而對其進(jìn)行調(diào)控［8］。目前，CIRCE元件在枯草芽孢桿菌［11］和金黃色葡萄球菌［12］中已被廣泛研究。大量研究表明，hrcA基因產(chǎn)物作為負(fù)調(diào)控因子，可通過與CIRCE元件結(jié)合而介導(dǎo)反饋抑制作用［13］。在低鹽、低溫等環(huán)境下，HrcA產(chǎn)物可抑制 dnaK操縱子相關(guān)結(jié)構(gòu)基因 dnaK、grpE及 dnaJ的表達(dá);當(dāng)鹽度、溫度升高后，這種抑制作用即得到解除，相關(guān)基因的表達(dá)量上升［14］。hrcA產(chǎn)物可充當(dāng)一類熱休克基因的負(fù)調(diào)控蛋白。對dnaK操縱子在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控，并使其轉(zhuǎn)錄由熱、鹽和乙醇等誘導(dǎo)［8］。

hrcA基因是枯草桿菌dnaK操縱子的第一個編碼基因，雖然枯草桿菌的3種熱休克基因由不同機(jī)制所調(diào)節(jié)，然而只有一個熱休克調(diào)節(jié)子是由瞬變的溫和的熱應(yīng)力所誘導(dǎo)的。有研究通過將枯草桿菌染色體上的dnaK操縱子第一個基因hrcA敲除，并構(gòu)建hrcA的無效突變體(null mutant)后進(jìn)行實驗發(fā)現(xiàn):來自野生型枯草桿菌和突變菌株的hrcA基因所編碼的蛋白質(zhì)HrcA均可在轉(zhuǎn)錄水平上強(qiáng)烈抑制熱休克所誘導(dǎo)的dnaK操縱子mRNA的表達(dá)水平，低溫下實驗時也得到了同樣的結(jié)果;提示，hrcA產(chǎn)物可充當(dāng)I類熱休克基因的負(fù)調(diào)控蛋白［15］。

對細(xì)菌熱休克操縱子的轉(zhuǎn)錄組織進(jìn)行分析的實驗結(jié)果顯示，初級轉(zhuǎn)錄物可以進(jìn)行進(jìn)一步的處理。Segal、Ron 等［1］(1996)就已經(jīng)證實，在農(nóng)桿菌熱休克反應(yīng)中g(shù)roESL多順反子存在位點特異性裂解，而這個基因間隔區(qū)的裂解是二次加工的，以允許在多順反子操縱子內(nèi)基因的差別表達(dá)。Homuth等［6］(1997)研究枯草芽孢桿菌dnaK操縱子的特殊裂解初級轉(zhuǎn)錄物時，描述了hrcA基因和grpE基因之間的基因間加工位點，并認(rèn)為其可能在基因差別表達(dá)中發(fā)揮一定的作用;此外，該研究還描述了枯草芽孢桿菌dnaK操縱子的位于dnaK編碼序列內(nèi)的降解位點，并認(rèn)為這些位點的裂解是通過引入核糖核酸外切酶插入位點來加速RNA分子的分解;同時還發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌的dnak操縱子的初級轉(zhuǎn)錄物也同樣會裂解產(chǎn)生較小的裂解產(chǎn)物，其裂解位點位于dnaK編碼序列內(nèi)，并據(jù)此認(rèn)為，在清酒乳桿菌中該位點所充當(dāng)?shù)膽?yīng)是降解位點而不是加工位點。

大部分的I類熱休克基因均具有單一組的CIRCE元件。枯草芽孢桿菌P23S啟動子表達(dá)系統(tǒng)具有受滲透壓調(diào)節(jié)、高表達(dá)水平系統(tǒng)的特性［16］。清酒乳桿菌LTH681的dnaK操縱子的轉(zhuǎn)錄組織與丙酮丁醇梭菌［5］和枯草芽孢桿菌［6］相似。轉(zhuǎn)錄起始位點的分析表明，清酒乳桿菌dnaK操縱子的上游是crA型啟動子(P2)，同時還發(fā)現(xiàn)該位點可根據(jù)所施加的應(yīng)力條件而發(fā)生改變;提示，該調(diào)節(jié)位點在DNA水平上起類似順式元件的作用，其可能參與mRNA在不同條件下的半衰期的調(diào)節(jié)［17］。另有研究發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌的啟動子(P3)能假定位于dnaK基因和dnaJ基因之間，其序列與枯草芽孢桿菌的crB-依賴型啟動子相似，并參與了Ⅱ類熱休克基因的誘導(dǎo)［18］。然而，清酒乳桿菌的啟動子(P3)并不表現(xiàn)為功能性，因為在P2啟動子調(diào)控下的，通過熱、鹽或乙醇等應(yīng)激誘導(dǎo)基因引物延伸的實驗中并沒有檢測到轉(zhuǎn)錄起始［19］。因此，我們可以得出結(jié)論:清酒乳桿菌中位于dnaK操縱子遠(yuǎn)端的dnaJ基因的轉(zhuǎn)錄是由啟動子P2和在終止子T2處的一段通讀所介導(dǎo)的。

3 dnaK操縱子的功能

dnaK操縱子對于細(xì)菌在各種環(huán)境壓力中生長具有重要意義。肉毒梭狀芽胞桿菌hrcA突變體實驗研究發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激后，hrcA突變體比野生菌株顯示出高水平的指數(shù)增長，而dnaK突變體在不同測試溫度、pH值、NaCl濃度條件下均顯示出生長抑制;提示，dnaK操縱子在肉毒梭狀芽孢桿菌應(yīng)對各種環(huán)境壓力時具有重要作用［11］。

嗜鹽四聯(lián)球菌是一種中度嗜鹽的 G+乳酸菌［20］，當(dāng)在高鹽濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，其菌細(xì)胞內(nèi)不僅積累鈉離子，還積累大量的鉀離子和多種有機(jī)物質(zhì)作為相容性溶質(zhì)［21］。對嗜鹽四聯(lián)球菌dnaK操縱子在高細(xì)胞內(nèi)滲透壓條件下的功能表達(dá)，以及蛋白質(zhì)疏水性相互作用結(jié)構(gòu)的增加進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其dnaK操縱子的特性能更好的解釋該菌的高鹽度適應(yīng)機(jī)制。

dnaK操縱子所編碼的蛋白DnaK(伴侶蛋白DnaK)主要由α-螺旋和β-折疊組成，基本不含無規(guī)則卷曲，具有耐熱蛋白質(zhì)的特征［22］。嗜鹽四聯(lián)球菌dnaK的氨基酸序列與乳酸乳球菌、清酒乳桿菌和枯草芽孢桿菌相應(yīng)的Dank同系物具有較高的相似性。使用pET表達(dá)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，嗜鹽四聯(lián)球菌的dnaK在大腸桿菌中過度表達(dá)，而純化的DnaK參與形成ATP酶以及重折疊活動;在大腸桿菌的耐熱機(jī)制中DnaK有蛋白聚集的預(yù)防和復(fù)性作用［23］。Northern雜交分析表明，dnaK基因的轉(zhuǎn)錄被熱休克誘導(dǎo)，幾個檢測到的轉(zhuǎn)錄物均包括一個四順反子的mRNA，相當(dāng)于完整的dnaK操縱子的尺寸;在高濃度NaCl而KCl濃度不同的條件下，dnaK轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量增加約3.5倍;以上結(jié)果表明，克隆的DnaK可充當(dāng)功能分子伴侶，并在鹽度適應(yīng)過程中起重要作用［24］。Jovanovic 等［24］認(rèn)為，在嗜鹽四聯(lián)球菌dnaK操縱子啟動子區(qū)域的兩個CIRCE元件可能有助于轉(zhuǎn)錄的精密調(diào)控，以制定適應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)對環(huán)境的壓力;大腸桿菌的熱休克蛋白70分子伴侶系統(tǒng)，因其許多功能而廣泛應(yīng)用于防止蛋白聚集，并可作為蛋白穩(wěn)定因子而適應(yīng)于脅迫條件。

另有研究發(fā)現(xiàn)，其他兩個熱休克蛋白DnaJ和GrpE可以激發(fā)DnaK伴侶的活性，在DnaJ和GrpE存在的條件下，DnaK的 ATPase活性可提高50倍［25］。目前，關(guān)于dnaK功能和高溫?fù)p傷之間的關(guān)系已被詳細(xì)研究［26］。近來有報道，大腸桿菌的dnaK突變株未能質(zhì)壁分離復(fù)原和適應(yīng)高鹽度，該突變株不能保持適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)K+濃度［27-28］。因此，dnaK操縱子對于大腸桿菌適應(yīng)高滲透壓十分重要。

4 dnaK操縱子的研究意義

盡管dnaK操縱子的分子機(jī)制尚未完全明了，但研究已發(fā)現(xiàn)了多種G+菌中dnaK伴侶蛋白的作用機(jī)制［29］，并分離和測定了許多細(xì)菌的dnaK操縱子以及與之相關(guān)的基因及其蛋白。同時還發(fā)現(xiàn)，dnaK基因編碼的熱休克蛋白DnaK蛋白(Hsp70)在保護(hù)微生物應(yīng)對環(huán)境壓力和食品保存中均扮演著重要的角色［30］。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對變異鏈球菌耐氟菌株的dnaK操縱子的研究也取得顯著成果。研究發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌耐氟菌株的耐酸性比親代菌株增強(qiáng)與dnaK操縱子有密切的聯(lián)系［31］。從而也為今后臨床更合理的應(yīng)用氟化物防齲，以及齲病預(yù)防藥物的研發(fā)提供了一定的理論及實驗基礎(chǔ)。關(guān)于肉毒梭狀芽胞桿菌的dnaK操縱子對該菌應(yīng)對各種環(huán)境壓力(溫度、pH 值、NaCl等)［11］的研究成果，對于應(yīng)對哺乳動物腸道傷口以及食物加工過程中肉毒桿菌增長的問題具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，dnaK操縱子編碼的DnaJ蛋白對于豬鏈球菌2型的耐熱性及其對宿主粘附機(jī)制均具有重要作用，加之DnaJ蛋白具有良好的免疫原性，提示DnaJ可能是潛在亞單位疫苗的候選［32］。

相信隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)各項研究技術(shù)的發(fā)展，dnaK操縱子的反應(yīng)機(jī)制將得到進(jìn)一步詮釋，也將為分子水平的預(yù)防、基因治療等提供新思路和新方法。

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