海蘭褐蛋雞卵巢與輸卵管FSHR及LHR基因定量的研究

何晶，耿仁德，計(jì)紅，馬莉，張虹亮，孔凡志，程曉旭，楊煥民

（1.黑龍江省農(nóng)墾哈爾濱管理局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，哈爾濱 150090；2.黑龍江省農(nóng)墾總局建三江分局勤得力農(nóng)場(chǎng)第六管理區(qū)；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

海蘭褐蛋雞卵巢與輸卵管FSHR及LHR基因定量的研究

何晶1，耿仁德2，計(jì)紅3，馬莉3，張虹亮3，孔凡志3，程曉旭3，楊煥民3

（1.黑龍江省農(nóng)墾哈爾濱管理局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，哈爾濱 150090；2.黑龍江省農(nóng)墾總局建三江分局勤得力農(nóng)場(chǎng)第六管理區(qū)；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

為了研究雞卵巢、輸卵管子宮部、輸卵管漏斗部FSHR及LHR基因表達(dá)水平差異，實(shí)驗(yàn)從海蘭褐蛋雞的子宮部、卵巢、漏斗部中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)獲得FSHR、LHR目的基因，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果顯示卵巢組織FSHR mRNA表達(dá)水平顯著高于子宮部與漏斗部組織（P＜0.01），子宮部與漏斗部組織FSHR mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異；子宮部組織LHR mRNA表達(dá)水平極顯著高于其他兩組（P＜0.01），但卵巢、漏斗部組織LHR mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究雞卵巢、輸卵管子宮部、輸卵管漏斗部FSHR及LHR基因表達(dá)水平差異，研究為今后研究禽類生殖生理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

蛋雞；促卵泡激素受體；促黃體生成素受體；基因表達(dá)量；熒光定量

促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）是家禽生殖系統(tǒng)的主要調(diào)控激素，其他有許多激素是通過(guò)對(duì)這兩種激素分泌的影響而間接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。FSH是垂體分泌的一種糖蛋白激素，是促進(jìn)和維持性腺的正常發(fā)育和生殖功能的重要激素。它的生理作用是通過(guò)分布于顆粒細(xì)胞的特異性受體—FSH受體（FSHR）所介導(dǎo)。黃體生成素受體（Luteinizing hormone receptor，LHR）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族

中的糖蛋白亞家族成員[1]，可以加快卵巢的血液循環(huán)，促進(jìn)被FSH預(yù)處理過(guò)的卵泡成熟并誘發(fā)排卵。盡管LH對(duì)卵泡發(fā)育和排卵的作用明顯，但這種影響往往與其和FSH的協(xié)同是分不開的。

禽類的卵巢是產(chǎn)生卵細(xì)胞的部位；輸卵管漏斗部，即輸卵管的傘狀部，是運(yùn)送卵細(xì)胞和提供受精的部位，也是卵子的受精部位。而子宮部（殼腺部）主要是形成石灰質(zhì)卵殼，防止細(xì)菌的侵入。目前，作為FSH和LH兩種生殖激素受體FSHR與LHR在上述部位的表達(dá)水平少有研究，因此研究主要應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)海蘭褐蛋雞輸卵管子宮部、卵巢、輸卵管漏斗部FSHR及LHR受體基因表達(dá)水平，為今后研究禽類生殖生理、產(chǎn)蛋性能及生殖激素與抱性方面的學(xué)者提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品采集和試劑

選取實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的產(chǎn)蛋期海蘭褐雞6只，通過(guò)科學(xué)飼養(yǎng)并同時(shí)記錄產(chǎn)蛋情況，可提前預(yù)測(cè)排卵時(shí)間。臨檢健康后，取海蘭褐蛋雞的卵巢、輸卵管的子宮部和漏斗部樣品，置于-80℃保存。

實(shí)驗(yàn)中采用的試劑主要有氯仿，異丙醇，乙醇，DEPC處理水，TRIzol，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，TaKaRa Taq，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，DNA marker，DNA凝膠回收與純化試劑盒，6*loading Buffer，培養(yǎng)液（Hyclone M199），瓊脂糖，Tris，EDTA，熒光染料等。

1.2 提取顆粒細(xì)胞總RNA

從-80℃冰箱中取出裝有卵巢、輸卵管子宮部和漏斗部樣品各0.2 g，置于液氮預(yù)冷的研缽中用石英砂研磨至無(wú)可見(jiàn)顆粒。參考Trizol法RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA。

1.3 總RNA質(zhì)量的檢測(cè)

采用瓊脂糖凝膠電泳與核酸定量分析儀鑒定RNA質(zhì)量和濃度。

檢測(cè)總RNA濃度及其純度：將1 μL總RNA溶解于99 μL DEPC處理水中，應(yīng)用核酸定量分析儀測(cè)定提取的RNA的OD值，OD260與OD280之間的比值應(yīng)在1.6～2.0之間。

檢測(cè)總RNA完整性以及有無(wú)嚴(yán)重的污染現(xiàn)象：取1 μL總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)5 S、18 S和28 S三條帶，從而確定提取的總RNA是否能用于下一步試驗(yàn)。

1.4 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI上注冊(cè)發(fā)表的FSHR、LHR以及GAPDH（內(nèi)參）原雞核苷酸序列，利用Primer Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增海蘭褐蛋雞FSHR、LHR以及GAPDH基因的引物，以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物如下表1所示。

表1 目的基因引物與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1Primers of purpose gene and product length of PCR amplification

1.5 RT-PCR反應(yīng)

分別加入1 μL 50 μM的Oligo（dT18），4 μL DEPC處理水到各樣品提取的1 μL總RNA模板中，總體積為6 μL。均勻混合后70℃水浴10 min，取出后迅速放置于冰上2 min。離心使混合液沉于管底。在管中加入2 μL的5xM-MLV Buffer，0.5 μL的 10 mM的dNTP，0.25 μL的40 U·μL-1RNase Inhibitor，0.25～1 μL的DEPC處理水，使總體積為10 μL?；靹蚝?2℃水浴60 min。完成上步驟，則置于70℃水浴15 min，取出后在冰上急冷1 min，離心使溶液沉于管底。將獲得的cDNA用于下步PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.6 PCR反應(yīng)體系

將反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，設(shè)計(jì)合成的FSHR、LHR和GAPDH基因的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增達(dá)到相應(yīng)的基因片段。50 μL PCR體系如表2：cDNA模板1.0 μL；10×PCR Buffer 5.0 μL；P1（20 pmol·μL-1）1.0 μL；P2（20 pmol·μL-1）1.0μL；dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1each）8.0 μL；Taq酶（5 U·μL-1）0.5 μL，加水至總體積50 μL。

擴(kuò)增FSHR基因的PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 sec，56℃退火30 sec，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增LHR基因的PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 sec，52℃退火30 sec，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。GAPDH在以上兩個(gè)PCR反應(yīng)參數(shù)下均能反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，利用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)后吸取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠檢測(cè)，由于所擴(kuò)增的基因片段都小于400 bp，故選用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢驗(yàn)擴(kuò)增的結(jié)果，并應(yīng)用紫外燈觀察結(jié)果。

1.7 基因測(cè)序驗(yàn)證

從瓊脂糖膠上切下與預(yù)期大小一致的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化，將其與PMD-18-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布與氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃溫育12 h，挑取白色單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)移有約3～4 mL氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜。堿裂解法小劑量制備質(zhì)粒，酶切和PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定結(jié)果應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAstar與引物設(shè)計(jì)所參考的DNA序列，進(jìn)行同源性分析，從而驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。

1.8 熒光定量

使用SYBR Premix Ex TaqⅡ（寶生物染料法熒光定量試劑盒）進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)，反應(yīng)體系與1.6一致。

2 結(jié)果

2.1 總RNA電泳結(jié)果

提取的蛋雞組織總RNA，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，圖1中可看到28 S、18 S和5 S這幾條帶。從上至下可觀察到，28 S條帶最亮，18 S條帶略暗，5 S條帶較暗，由此可知，提取的RNA較為完整，符合繼續(xù)試驗(yàn)的要求。核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的OD260/280值在1.80～2.00之間，同樣也符合試驗(yàn)要求。

圖1 RNA提取結(jié)果Fig.1Agarose gel electrophoresis of total RNA

2.2 RT-PCR擴(kuò)增目的片段結(jié)果

采用RT-PCR擴(kuò)增目的片段后，1%瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠置于紫外燈下觀察，觀察到與預(yù)期大小相符的目的條帶（86 bp、207 bp、191 bp），且PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶單一，證明引物序列設(shè)計(jì)特異性較高，結(jié)果如圖2。

圖2 GAPDH，F(xiàn)SHR，LHR目的基因PCR產(chǎn)物Fig.2Agarose gel electrophoresis of PCR product for GAPDH，F(xiàn)SHR and LHR

2.3 核酸序列測(cè)定結(jié)果與序列分析

利用DNAstar等軟件分別對(duì)GAPDH、FSHR、LHR、基因重組質(zhì)粒核酸序列，將其與參考序列進(jìn)行同源性分析（進(jìn)行序列對(duì)比時(shí)，上排序列為了試驗(yàn)擴(kuò)增的雞基因，下排為NCBI上發(fā)表的原雞基因），結(jié)果如下。

GAPDH核酸測(cè)序結(jié)果與原雞比對(duì)同源性為98.9%，如圖3：

圖3 克隆蛋雞GAPDH基因片段與NCBI發(fā)表的原雞序列的同源性分析Fig.3Homology analysis of the target gene segment of GAPDH clone and NCBI gallus

FSHR核酸測(cè)序結(jié)果與原雞比對(duì)同源性為96.2%，如圖4。

圖4 克隆蛋雞FSHR基因片段與NCBI發(fā)表的原雞序列的同源性分析Fig.4Homology analysis of the target gene segment of FSHR clone and NCBI gallus

LHR核酸測(cè)序結(jié)果與原雞比對(duì)同源性為98.95%，如圖5。

圖5 克隆蛋雞LHR基因片段與NCBI發(fā)表的原雞序列的同源性分析Fig.5Homology analysis of the target gene segment of LHR clone and NCBI gallus

2.4 熒光定量檢測(cè)mRNA表達(dá)結(jié)果

應(yīng)用熒光定量?jī)x檢測(cè)輸卵管子宮部、卵巢、輸卵管漏斗部三組中FSHR和LHR的表達(dá)情況（見(jiàn)圖6和圖7）。結(jié)果顯示：如圖6子宮部與漏斗部FSHR表達(dá)水平差異不顯著，卵巢組織FSHR mRNA表達(dá)水平與其他兩組存在極顯著性差異（P＜0.01）；圖7卵巢與漏斗部LHR表達(dá)水平差異不顯著，子宮部LHR mRNA表達(dá)水平與其他兩組存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖6 FSHR mRNA的表達(dá)情況Fig.6Gene expression quantities of FSHR mRNA

圖7 LHR mRNA的表達(dá)情況Fig.7Gene expression quantities of LHR mRNA

3 討論

與哺乳動(dòng)物一樣，禽類生殖活動(dòng)也主要受生殖軸下丘腦、垂體、性腺軸的激素調(diào)節(jié)，受GnRH對(duì)促性腺激素細(xì)胞的刺激，垂體中促卵泡素（FSH）開始合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)[2]并最終作用于卵巢和睪丸的FSHR，合成并分泌相應(yīng)的生殖腺激素參與繁殖行為的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)促黃體素（LH）等激素的合成與釋放，從而促進(jìn)卵泡的發(fā)育和成熟，對(duì)動(dòng)物繁殖性狀的調(diào)控起著重要作用。在過(guò)去的十多年里，人們也逐漸發(fā)現(xiàn)FSH和LH除了影響傳統(tǒng)的性腺靶位點(diǎn)（如卵巢）外，促性腺激素受體還存在于整個(gè)生殖道的輸卵管、子宮內(nèi)膜、子宮肌層、子宮頸和子宮血管中[3]。

FSHR與LHR分別是FSH與LH發(fā)揮作用的結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)SH和LH在動(dòng)物繁殖領(lǐng)域具有重要作用，即能夠調(diào)節(jié)性腺發(fā)育，調(diào)控性激素的分泌，維持動(dòng)物第二性征和性行為，這使FSHR和LHR成為提高禽類產(chǎn)蛋性能的研究目標(biāo)之一。方弟安等研究發(fā)現(xiàn)皖西白鵝在產(chǎn)蛋前1周FSHβ mRNA表達(dá)維持較高水平直至產(chǎn)蛋10天達(dá)最高，到休產(chǎn)期和就巢前期迅速下降，進(jìn)入就巢末期，F(xiàn)SHβ mRNA水平在此上升達(dá)到較高水平[4-5]。FSHβ mRNA水平規(guī)律性變動(dòng)說(shuō)明FSH與皖西白鵝的產(chǎn)蛋關(guān)系密切[7]。試驗(yàn)檢測(cè)了LHR和FSHR在蛋雞的子宮部、卵巢、漏斗部的表達(dá)量差異，結(jié)果顯示子宮部、卵巢、漏斗部FSHR存在顯著差異，卵巢FSHR極顯著高于其他兩個(gè)部位，提示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正處于產(chǎn)蛋高峰期，卵巢機(jī)能處于良好水平。輸卵管漏斗部的FSHR有具有較高的表達(dá)量，因?yàn)槁┒凡渴乔蓊惵雅菔芫课?，提示FSH與FSHR結(jié)合后對(duì)禽類的受精有重要作用。

黃體生成素（LH）是由垂體前葉促黃體素細(xì)胞（嗜堿性細(xì)胞）產(chǎn)生的一種糖蛋白激素，在FSH的協(xié)同作用下促使排卵，形成黃體并分泌孕激素。在雌禽的排卵周期內(nèi)，由于垂體不斷釋放FSH和LH，刺激卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，不斷生長(zhǎng)的卵泡合成孕酮逐漸增加，刺激垂體釋放LH，當(dāng)孕酮對(duì)垂體的刺激達(dá)到一定的闡值，引起LH的大量釋放，使排卵前的LH達(dá)峰值，高水平的LH作用于成熟的卵泡促發(fā)排卵[8]。LH是潛在的能夠調(diào)節(jié)輸卵管功能的循環(huán)激素中的一種，并且已經(jīng)在人、牛、豬和山羊的輸卵管中證實(shí)了LHR的存在[9-10]。但是在研究中發(fā)現(xiàn)子宮部LHR mRNA顯著高于其他兩組，漏斗部和卵巢之間差別卻不顯著，提示LH對(duì)雞輸卵管子宮部功能可能有較大的調(diào)節(jié)作用。

實(shí)驗(yàn)成功提取了總RNA，反轉(zhuǎn)了cDNA，成功的通過(guò)熒光定量PCR的技術(shù)檢測(cè)LHR和FSHR在蛋雞的子宮部、卵巢、漏斗部的表達(dá)量差異，為探索禽類產(chǎn)蛋性能機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

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Genetic Quantitative Research of FSHR and LHR in Ovary and Oviduct of Hy-line Brown Laying Hens

He Jing1，Geng Rende2，Ji Hong3，Ma Li3，Zhang Hongliang3，Kong Fanzhi3，Cheng Xiaoxu3，Yang Huanmin3
（1.Institute of Animal Health Supervision，Harbin Urban Administration of Land Reclamation Bureau in Heilongjiang Province，Harbin 150036；2.The Sixth District of Qindeli Farm of Jiansanjiang Land Reclamation Bureau，Heilongjiang Land Reclamation Bureau；3.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to study the expression level of FSHR and LHR in ovary，the tubal uterine department and fallopian tube funnel department，ovary，tubal uterine department and fallopian tube funnel department were obtained from Hy-line brown laying hens，and the total RNA was extracted.FSHR and LHR target genes were amplificatied by using qRT-PCR，and the amount of FSHR and LHR were detected by fluorescent quantitative PCR.The results showed that FSHR mRNA expression level in ovarian tissue was extremely significantly higher than in the tubal uterine department and fallopian tube funnel department（P＜0.01），and FSHR mRNA expression level in the tubal uterine department and fallopian tube funnel department had no significant difference.LHR mRNA expression level in tubal uterine department was extremely significantly higher than in ovary and fallopian tube funnel department（P＜0.01），and LHR mRNA expression level in ovary and fallopian tube funnel department had no significant difference.The study illustrated the expression of FSHR and LHR in ovary，tubal uterine department and fallopian tube funnel department，which provided the foundation for the study on reproductive physiology of poultry.

hens；FSHR；LHR；gene expression level；fluorescence quantitative

S879.3

A

1002-2090（2015）02-0027-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2015.02.007

2014-08-15

何晶（1965-），女，高級(jí)獸醫(yī)師，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事禽類生殖生理學(xué)方面的研究工作。

楊煥民，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：yanghuanmin@aliyun.com。