脂多糖致帕金森病動物模型研究進展

何 歡，吳 霞

(首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

1 神經(jīng)炎癥與帕金森病

帕金森病(Parkinson's disease，PD)，又名震顫麻痹，1817年由英國醫(yī)生James Parkinson首先系統(tǒng)描述，常見于中老年人，60歲以上的人群中約2%患有帕金森病，是繼阿爾茨海默病之后的第二個最常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。其病理特點是中腦多巴胺(DA)能神經(jīng)元的丟失，以及α-突觸核蛋白(α-synuclein)為主要成分的路易小體的形成［1］。當中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失大約50%，紋狀體內(nèi)多巴胺濃度降低80%時出現(xiàn)臨床癥狀［2］，包括運動遲緩、震顫、強直、姿勢步態(tài)失調(diào)等運動癥狀，以及嗅覺障礙、植物神經(jīng)功能紊亂、抑郁、認知及睡眠障礙等非運動相關的癥狀。目前，PD的發(fā)病機制仍不是很清楚，其主要機制涉及氧化應激、線粒體功能障礙、興奮性毒性、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏及免疫調(diào)節(jié)異常等。近些年的研究表明神經(jīng)性炎癥能明顯促進帕金森病的進程，尤其是小膠質(zhì)細胞的激活及促炎性因子、神經(jīng)毒素的表達，能引起帕金森病患者多巴胺能神經(jīng)元的丟失［3，4］。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐免疫細胞，主要參與腦內(nèi)的固有免疫反應，能夠清除細胞碎片和外來異物，發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。當腦組織出現(xiàn)感染、外傷、缺血或是神經(jīng)變性疾病引起的神經(jīng)元損傷時，小膠質(zhì)細胞會被迅速激活，形態(tài)逐漸發(fā)生改變，從靜止的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變成運動的阿米巴形狀，并釋放大量炎癥因子。對于小膠質(zhì)細胞激活后是發(fā)揮神經(jīng)保護作用還是產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，一直沒有定論［5］。一方面，激活的小膠質(zhì)細胞通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎因子發(fā)揮保護作用;另一方面，大量激活的小膠質(zhì)細胞通過產(chǎn)生大量氧自由基，如超氧化物、細胞內(nèi)活性氧、過氧化氫、羥自由基、一氧化氮(NO)以及細胞毒性因子，如白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子 - α(TNF- α)、前列腺素 E2(PGE2)等損傷神經(jīng)元［3］。此外，損傷的神經(jīng)元會繼續(xù)引起小膠質(zhì)細胞的過度激活，從而在神經(jīng)元凋亡和小膠質(zhì)細胞激活之間形成一種惡性循環(huán)，導致更多的神經(jīng)元變性死亡［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在PD患者的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中確實存在激活的小膠質(zhì)細胞［6］。因此，研究PD進程中的炎癥反應是必要的，它可以幫助我們理解PD的病理機制并研究有效的治療藥物。

在過去20年間，PD動物模型的研究表明，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的神經(jīng)炎癥可以復制一些PD的特征，包括小膠質(zhì)細胞的過度激活以及黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元選擇性損傷［7～10］。LPS為革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是重要的內(nèi)毒素，能刺激機體產(chǎn)生炎癥反應。研究表明LPS進入到腦中可以結(jié)合小膠質(zhì)細胞膜上的CD14樣受體，激活Toll樣受體4，由此引起小膠質(zhì)細胞的激活，從而導致神經(jīng)元的損傷［11］。

2 不同部位給予LPS致PD動物模型

2.1 黑質(zhì)內(nèi)注射LPS 中腦黑質(zhì)區(qū)域分布著多巴胺能神經(jīng)元和大量小膠質(zhì)細胞，1998年，Casta?o等［7］報道了黑質(zhì)內(nèi)注射LPS造成PD大鼠模型。在黑質(zhì)區(qū)域立體定位注射LPS后，發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細胞激活，并且黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元缺失，試驗結(jié)果表明炎癥反應尤其是小膠質(zhì)細胞的激活對PD的病理進程有重要影響。小膠質(zhì)細胞為腦內(nèi)常駐免疫細胞，正常狀態(tài)下起到免疫監(jiān)視作用，其形態(tài)為靜止的分叉狀，當接觸到致炎因子后，小膠質(zhì)細胞會過渡到棒狀的激活狀態(tài)，繼而變成阿米巴樣的完全激活狀態(tài)。急慢性黑質(zhì)內(nèi)注入LPS實驗表明，LPS可以誘導小膠質(zhì)細胞激活，并且有劑量和時間依賴性［12，13］。Herrera 等［14］在隨后的研究中，通過觀察注射LPS一年后大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元存活情況，證明LPS誘導的多巴胺能神經(jīng)元損毀是不可逆的。而且，LPS對DA能神經(jīng)元的損害作用具有選擇性，可以觀察到LPS在損毀黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的同時，γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元和5-羥色胺(5-HT)能神經(jīng)元并不受影響。此后，更多的研究證實了上述結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)在注射LPS后，黑質(zhì)部位促炎性細胞因子包括IL-1β、TNF-α、IL-6和NO等水平增高，這些促炎性細胞因子可能是LPS致神經(jīng)元損傷的起因［15～17］。此外，黎鋼等［18］探究了 LPS 對大鼠行為學和單胺類遞質(zhì)的影響，結(jié)果表明LPS注入黑質(zhì)特異性損害DA能神經(jīng)元，可降低紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物含量，阿樸嗎啡可誘導大鼠產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為。

LPS立體定位注射到中腦黑質(zhì)區(qū)域可更好模擬小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)元損傷之間的相互作用，有利于研究黑質(zhì)區(qū)域炎癥對PD病理變化的影響。

2.2 蒼白球內(nèi)注射LPS 蒼白球是位于大腦兩側(cè)半球深部的基底核的重要組成部分，基底核是錐體外系的中繼核，可以將來自大腦皮質(zhì)、丘腦等處的神經(jīng)沖動經(jīng)蒼白球發(fā)出纖維至丘腦而與大腦皮質(zhì)聯(lián)系。蒼白球的下行纖維，通過紅核、黑質(zhì)、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等影響脊髓下運動神經(jīng)元。因此，基底核作為一個整體，蒼白球可以影響到黑質(zhì)紋狀體的通路和功能。目前已有研究結(jié)果表明LPS注射到蒼白球可模擬PD的生化及行為改變，如大鼠活動減少、運動遲緩、黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元減少、多巴胺含量降低、小膠質(zhì)細胞持續(xù)活化等。Zhang等［8］將LPS立體定位注射到大鼠蒼白球，試驗結(jié)果顯示黑質(zhì)和蒼白球區(qū)域小膠質(zhì)細胞均被激活，黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元及其蛋白表達顯著減少，并且大鼠自主活動減少。也有研究發(fā)現(xiàn)蒼白球注射LPS的大鼠促炎性細胞因子水平顯著升高，包括IL-1β、TNF-α和IL-6，誘導型一氧化氮合酶表達增多，并增強了α-synuclein在黑質(zhì)的聚集。與低齡大鼠比較，上述病理變化在中年大鼠中更顯著，該結(jié)果也支持了老齡化是帕金森病的一個誘因的觀點［19］。

2.3 紋狀體內(nèi)注射LPS 在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中多巴胺能神經(jīng)元的胞體位于黑質(zhì)內(nèi)，而其富含多巴胺遞質(zhì)的神經(jīng)纖維分布在紋狀體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)LPS注射到大鼠紋狀體后，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元胞體和紋狀體軸突末端逐漸變性死亡，紋狀體內(nèi)多巴胺含量降低，α-synuclein和泛素蛋白在神經(jīng)元細胞質(zhì)內(nèi)積聚，并且大鼠出現(xiàn)行為學障礙［10，20，21］。Hunter等［22］將LPS立體定位注射到C57/B6小鼠紋狀體內(nèi)，試驗結(jié)果表明LPS能夠致小鼠多巴胺能神經(jīng)元變性缺失，并且呈劑量和時間依賴性，在小鼠紋狀體分別注射 5、7.5、10 μg 的 LPS，1周后TH陽性神經(jīng)元缺失分別達到23%、45%、61%，注射5 μg LPS，4周后TH陽性神經(jīng)元缺失達到72%、12周后達到81%，并且多巴胺含量顯著降低，與對照組相比，LPS組小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間明顯降低。該研究成功復制了PD相關癥狀的小鼠模型。

紋狀體內(nèi)注射LPS可引起神經(jīng)毒性，其分子機制可能有多種，包括黑質(zhì)和紋狀體區(qū)域內(nèi)小膠質(zhì)細胞的激活、線粒體損傷、以及 IL-1β、TNF- α、IL-6、IL-1α、NO 等促炎性細胞因子的釋放。這表明紋狀體內(nèi)的炎癥刺激不僅直接損害紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元軸突末端，還間接損傷黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元胞體，其具體信號傳導通路有待進一步研究［10，20，22］。

2.4 腦室內(nèi)注射LPS 李軍泉等［23］通過腦室注射 LPS激活腦內(nèi)炎癥反應，觀察腦內(nèi)炎癥變化情況，大鼠行為學改變，以及對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的影響。結(jié)果表明腦室注射LPS后能引起腦室內(nèi)小膠質(zhì)細胞的廣泛激活，其激活程度隨時間而逐漸增高，注射后24 h激活程度最高。黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細胞激活要晚于紋狀體及海馬，說明腦室注射LPS后炎癥反應在腦內(nèi)由近及遠擴散。Zhou等［24］將LPS注射到大鼠單邊側(cè)腦室，在不同時間點觀察LPS的長期神經(jīng)毒性作用。第4周在海馬和紋狀體的小膠質(zhì)細胞被激活，而在第24周黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細胞才被激活，TH陽性神經(jīng)元出現(xiàn)胞體萎縮死亡。α-synuclein在第12周聚集增多，并在24周達到最多，反常的運動行為在第16周出現(xiàn)并持續(xù)到了48周。此研究結(jié)果表明，側(cè)腦室內(nèi)注射LPS與黑質(zhì)或紋狀體內(nèi)局部注射LPS建立的大鼠模型不同，本模型能更好地模擬PD的慢性漸進性變性過程，多巴胺能神經(jīng)元的損傷較為緩慢，具有時間依賴性。

2.5 腹腔內(nèi)注射LPS 全身系統(tǒng)性炎癥曾被懷疑能否影響腦內(nèi)免疫細胞激活進而促進PD的神經(jīng)退行性病變。但有研究表明C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS可引起小膠質(zhì)細胞的激活和多巴胺能神經(jīng)元退行性病變，7個月和10個月時多巴胺能神經(jīng)元丟失分別為23%和43%［25］。腹腔注射的LPS不能進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起炎癥，早期文獻報道內(nèi)毒素LPS注射到大鼠體內(nèi)不能破壞血腦屏障的通透性［26］。然而一些促炎性因子包括TNF-α和IL-1，可以通過血腦屏障，直接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能［27］。

細菌內(nèi)毒素LPS，作為一種小膠質(zhì)細胞激活劑，當以腹腔注射的形式應用時，會將腦部一些不同區(qū)域的小膠質(zhì)細胞激活，不僅僅是黑質(zhì)部位，例如LPS也應用于阿爾茲海默病炎癥模型［28］，因此，腹腔注射LPS致PD多巴胺能神經(jīng)元退行性病變的分子機制需要進一步研究。

2.6 經(jīng)鼻吸入LPS 經(jīng)鼻通路連接鼻子和大腦，避開了血腦屏障，因此，空氣中的一些毒性物質(zhì)可以通過經(jīng)鼻通路進入大腦，影響大腦的功能。2013年，有學者通過LPS經(jīng)鼻吸入途徑成功制備了小鼠PD模型［29］，每只小鼠隔天右側(cè)經(jīng)鼻滴注LPS 10 μg，時間為5個月，實驗結(jié)果表明LPS單側(cè)經(jīng)鼻吸入可引起小鼠運動功能減退，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失及α-synuclein的沉積，紋狀體內(nèi)TH表達減少及DA等神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少。該模型呈現(xiàn)了PD的典型特征，可以用來研究慢性炎癥介導的PD發(fā)病機制以及發(fā)現(xiàn)以小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元相關聯(lián)的PD治療方法。李艷花等［30］采用LPS長時間、低劑量滴鼻方式給予C57BL/6小鼠，亦成功獲得了理想的PD模型，結(jié)果顯示鼻腔吸入LPS可以誘導小鼠運動功能改變，引發(fā)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失、激活小膠質(zhì)細胞及其NF-κB信號通路。

3 小結(jié)

根據(jù)LPS不同作用部位，可以將LPS致PD模型概括為兩類，第一類為LPS直接局部注射到黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)或其相關結(jié)構(gòu)，例如LPS立體定位注射到黑質(zhì)、紋狀體、蒼白球和腦室;第二類為LPS間接地全身給藥，選擇性影響黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，例如腹腔注射LPS和經(jīng)鼻吸入LPS。研究表明，由于多巴胺能神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞在共同區(qū)域，且多巴胺能神經(jīng)元更容易受到炎癥介導的神經(jīng)元損傷，因此第一類模型更容易導致多巴胺能神經(jīng)元的選擇性損傷。黑質(zhì)立體定位注射LPS，可以直接誘導小膠質(zhì)細胞的激活，造模時間短，但是由于黑質(zhì)結(jié)構(gòu)小，定位較難，且容易導致局部機械性損傷。紋狀體、蒼白球和腦室內(nèi)注射LPS不會引起黑質(zhì)局部機械性損傷，但其成模時間較長。第二類模型中，LPS如何致使黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元選擇性死亡至今仍不是很清楚，其具體分子機制需要進一步研究。因此第一類模型更適合應用于炎癥介導PD的病因?qū)W研究。

PD模型的建立在闡明PD發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點、新藥研發(fā)和篩選等方面具有重要意義，因此，建立一個穩(wěn)定可靠的PD實驗模型對研究PD的發(fā)病和治療顯得尤為重要。大量研究表明，以小膠質(zhì)細胞激活為代表的免疫炎癥在PD的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要作用。在LPS致PD動物模型中，LPS可刺激小膠質(zhì)細胞激活，引發(fā)神經(jīng)炎癥，誘導黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生一系列病理生理變化，能較好的模擬PD發(fā)病機制中的免疫炎癥機制，為研究PD進程中的炎癥反應奠定了基礎。此外，LPS致PD動物模型也為篩選以神經(jīng)炎癥為靶點的PD治療藥物提供了可靠的工具。

［1］張美蓉，孫芳玲，艾厚喜，等.帕金森病的炎癥及抗炎藥物的研究進展［J］.中國康復理論與實踐，2012，18(11):1040-1043.

［2］Toulouse A，Sullivan AM.Progress in Parkinson's disease—Where do we stand?［J］.Prog Neurobiol，2008，85(4):376-392.

［3］Kim YS，Joh TH.Microglia，major player in the brain inflammation:their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease［J］.Exp Mol Med，2006，38(4):333-347.

［4］BlockmL，Zecca L，Hong JS.Microglia-mediated neurotoxicity:uncovering the molecular mechanisms［J］.Nat Rev Neurosci，2007，8(1):57-69.

［5］任怡，葉民.膠質(zhì)細胞與帕金森病免疫/炎癥機制的關系［J］.臨床神經(jīng)病學雜志，2014，27(1):70-71.

［6］Imamura K，Hishikawa N，Sawada M，et al.Distribution of major histocompatibility complex class II-positive microglia and cytokine profile of Parkinson's disease brains［J］.Acta Neuropathol，2003，106(6):518-526.

［7］Casta?o A，Herrera AJ，Cano J，et al.Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system［J］.J Neurochem，1998，70(4):1584-1592.

［8］Zhang J，Stanton DM，Nguyen XV，et al.Intrapallidal lipopolysaccharide injection increases iron and ferritin levels in glia of the rat substantia nigra and induces locomotordeficits［J］.Neuroscience，2005，135(3):829-838.

［9］Qin L，Wu X，BlockmL，et al.Systemic LPS causes chronic neuroinflammation and progressive neurodegeneration［J］.Glia，2007，55(5):453-462.

［10］Choi D Y，Liu M，Hunter RL，et al.Striatal neuroinflammation promotes Parkinsonism in rats［J］.PLoS One，2009，4(5):e5482.

［11］Lehnardt S，Massillon L，F(xiàn)ollett P，et al.Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration through a Toll-like receptor 4-dependent pathway［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(14):8514-8519.

［12］Liu B，Jiang JW，Wilson BC，et al.Systemic infusion of naloxone reduces degeneration of rat substantia nigral do-paminergic neurons induced by intranigral injection of lipopolysaccharide［J］.J Pharmacol Exp Ther，2000，295(1):125－132.

［13］Gao HM，Jiang J，Wilson B，et al.Microglial activation －mediated delayed and progressive degeneration of rat nigral dopaminergic neurons:relevance to Parkinson's disease［J］.J Nurochem，2002，81(6):1285 －1297.

［14］Herrera AJ，Castano A，Venero JL，et al.The single intranigral injection of LPS as a new model for studying the selective effects of inflammatory reactions on dopaminergic system［J］.Neurobiol Dis，2000，7(4):429 －447.

［15］Lu X，Bing G，Hagg T.Naloxone prevents microglia－induced degeneration of dopaminergic substantia nigra neurons in adult rats［J］.Neuroscience，2000，97(2):285－291.

［16］Hernández－ Romero MC，Argüelles S，Villarán RF，et al.Simvastatin prevents the inflammatory process and the dopaminergic degeneration induced by the intranigral injection of lipopolysaccharide［J］.J Neurochem，2008，105(2):445－459.

［17］Arimoto T，Choi D，Lu X，et al.Interleukin－10 protects against inflammation－mediated degeneration of dopaminergic neurons in substantia nigra［J］.Neurobiol Aging，2007，28(6):894 －906.

［18］黎鋼，孫圣剛，曹學兵，等.脂多糖注入黑質(zhì)對大鼠黑質(zhì)紋狀體單胺類遞質(zhì)和行為的影響［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2004，21(1):16 －18.

［19］Choi DY，Zhang J，Bing G.Aging enhances the neuroinflammatory response and α－synuclein nitration in rats［J］.Neurobiol Aging，2010，31(9):1649－1653.

［20］Hunter RL，Dragicevic N，Seifert K，et al.Inflammation induces mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in the nigrostriatalsystem［J］.J Neurochem，2007，100(5):1375 －1386.

［21］Hunter RL，Choi DY，Kincer JF，et al.Fenbendazole treatment may influence lipopolysaccharide effects in rat brain［J］.Comp Med，2007，57(5):487 －492.

［22］Hunter RL，Cheng B，Choi DY，et al.Intrastriatal lipopolysaccharide injection induces parkinsonism in C57/B6 mice［J］.J Neurosci Res，2009，87(8):1913 －1921.

［23］李軍泉，張進祿，徐群淵.腦室注射脂多糖引起腦內(nèi)炎癥反應及其對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元影響的研究［A］.中國神經(jīng)科學學會第四次會員代表大會暨第七屆全國學術會議論文集［C］.2007.

［24］Zhou Y，Zhang Y，Li J，et al.A comprehensive study on long－term injury to nigral dopaminergic neurons following intracerebroventricular injection of lipopolysaccharide in rats［J］.J Neurochem，2012，123(5):771 －780.

［25］Perry VH.The influence of systemic inflammation on inflammation in the brain:implications for chronic neurodegenerative disease［J］.Brain Behav Immun，2004，18(5):407－413.

［26］Bickel U，Grave B，Kang YS，et al.No increase in blood–brain barrier permeability after intraperitoneal injection of endotoxin in the rat［J］.J Neuroimmunol，1998，85(2):131－136.

［27］Banks WA.Blood－brain barrier transport of cytokines:a mechanism for neuropathology［J］.Curr Pharm Des，2005，11(8):973 －984.

［28］Miklossy J.Chronic inflammation and amyloidogenesis in Alzheimer's disease－role of Spirochetes［J］.J Alzheimers Dis，2008，13(4):381 －391.

［29］He Q，Yu W，Wu J，et al.Intranasal LPS－mediated Parkinson's model challenges the pathogenesis of nasal cavity and environmentaltoxins［J］.PLoS One，2013，8(11):e78418.

［30］李艷花，和青，尉杰忠，等.硫辛酸對LPS誘導的帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響［J］.中國病理生理雜志，2015，31(2):201－206.