龍茭2號不同發(fā)育階段莖部活性氧的檢測分析

康璐瑤，崔海峰，邢阿寶，李帥，葉子弘

（中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計量與檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，杭州，310018）

茭白（Zizania latifoliaTurcz）又名茭瓜、茭筍、菰手、雕胡，屬于禾本科多年生水生宿根性草本植物，無性繁殖，原產(chǎn)于中國和東南亞[1]，是我國第二大水生蔬菜，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。茭白孕茭與茭白黑粉菌侵染茭白植株密切相關(guān)，茭白黑粉菌侵染茭白成功后，茭白的開花受到抑制，就會刺激茭白莖部膨大，形成可食用的膨大莖[2]。茭白黑粉菌是一種寄生真菌，其侵染茭白使茭白莖部膨大形成可食用肉質(zhì)莖的過程，實際上就是一個感病的過程。研究發(fā)現(xiàn)植物受到病原物侵染，會誘導(dǎo)活性氧暴發(fā)，而大量活性氧的積累會造成細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷[3]。因此，植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一系列的免疫防御反應(yīng)，存在多種活性氧清除機(jī)制，其中酶促保護(hù)機(jī)制，如超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶（POD）在活性氧的清除中具有重要作用[4，5]。

本試驗對茭白與黑粉菌互作中龍茭2號植株自身的活性氧激活及相關(guān)保護(hù)酶的變化進(jìn)行分析，通過對茭白不同部位中2種保護(hù)酶的活性變化分析，探討了茭白孕茭過程中茭白黑粉菌侵染引發(fā)的應(yīng)激防御反應(yīng)，為闡明茭白與黑粉菌互作機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為雙季茭白龍茭2號，選取3個不同時期（5、10、15 cm）的膨大莖部。試驗所需材料在桐鄉(xiāng)董家茭白基地采集。

1.2 試驗方法

采用NBT組織染色法染色觀察，選取不同發(fā)育階段生長良好的龍茭2號茭白，設(shè)定肉質(zhì)莖長度依次為5、10、15 cm，用刀片分別切取其尖端、中部和基部并制成切片，盡量使切片厚薄均勻。將制作好的樣品放入盛有750 μmol/L NBT溶液的平皿中，使NBT溶液沒過樣品，室溫染色6 h后，超純水洗滌3次后于電子顯微鏡下觀察染色情況。

參照宋鳳鳴等[6]的方法測定SOD活性，參照秦國政等[7]的方法測定POD活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 NBT組織定位染色結(jié)果

NBT染色后觀察茭白莖部O2-·的分布狀態(tài)，可以看出橫切面（圖1A）中維管束位置染色較深，其他部位染色較淺；縱切（圖1B）染色發(fā)現(xiàn)茭白莖部的O2-·主要分布在維管束周圍，局部成片分布。由此可見，莖部膨大過程中，龍茭2號莖部各部分均有O2-·的存在，O2-·的分布可能是沿著維管束生長的方向四周分散。

對不同發(fā)育階段龍茭2號茭白的基部、中部、尖端進(jìn)行NBT染色觀察發(fā)現(xiàn)（圖2），茭白莖部肉質(zhì)莖膨大過程中，SOD在不同發(fā)育階段各部分均存在活性表達(dá)，不同部位NBT著色程度不同，在15 cm長度的茭白莖部中，莖基部及中部著色較深，尖端著色較淺，而在5 cm長度的茭白莖部，莖尖端著色較深。茭白不同發(fā)育階段的各部位著色程度不同，說明不同發(fā)育階段及不同部位O2-·的分布存在差異。

2.2 SOD活性變化

圖3表明，同一發(fā)育時期中，莖中部的SOD活性大多高于基部及尖端。不同發(fā)育時期，發(fā)育早期（5 cm）SOD活性較高；隨著發(fā)育時期的推進(jìn)，SOD活性先降低后升高；但不同發(fā)育期間茭白莖部尖端部分SOD的活性較穩(wěn)定，且在發(fā)育早期SOD活性均高于其他兩個時期。在龍茭2號的3個發(fā)育時期中，莖基部、中部及尖端SOD活性變化趨勢均表現(xiàn)為先升后降，與NBT染色觀察結(jié)果基本一致。

2.3 過氧化物酶（POD）活性變化

由圖4可以看出，龍茭2號莖部POD活性在發(fā)育時期及分布部位中均有差異：同一發(fā)育階段的莖中部POD酶活最低、尖部最高；莖部不同發(fā)育階段的基部、中部和尖端POD酶活均呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢；同一發(fā)育階段中尖端POD活性最高、基部次之、中部最低。

圖1 茭白莖部NBT染色的橫切及縱切觀察

圖2 茭白莖部不同發(fā)育階段染色觀察

3 討論與結(jié)論

茭白是我國除蓮藕外的第二大水生蔬菜，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[8]。目前研究表明，茭白孕茭與茭白黑粉菌的侵染密切相關(guān)。茭白組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，茭白莖部分布著大量的茭白黑粉菌，正常交白莖部黑粉菌以菌絲形態(tài)存在，可在薄壁組織細(xì)胞間穿梭繞行，也可以直接穿過細(xì)胞在莖部伸展[9]。茭白黑粉菌侵染茭白的機(jī)制目前尚不明確，但是茭白孕茭過程中黑粉菌的侵染共生必然引發(fā)茭白植株產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)，并在共生孕茭過程中保持一種應(yīng)急防御平衡。本試驗通過茭白莖部NBT染色觀察發(fā)現(xiàn)，茭白莖部存在活性氧的激活及相關(guān)的保護(hù)酶的表達(dá)調(diào)控，保護(hù)酶染色在莖部各部位均能觀察到，但在維管束周圍顏色較深，可能是維管束周圍的保護(hù)酶活性較高。部分保護(hù)酶的活性變化可能與茭白黑粉菌侵染相關(guān)。

圖3 龍茭2號SOD活性變化

圖4 龍茭2號POD活性變化

病原真菌侵染植株時會引發(fā)植物自身的應(yīng)激防御反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)植物免受病原真菌侵害，目前針對活性氧暴發(fā)等相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)，植物體內(nèi)形成了2種主要的保護(hù)機(jī)制，包括酶促和非酶促兩類[10]。研究表明，這2種保護(hù)機(jī)制在植物體內(nèi)活性氧的清除和維持中具有重要作用[11]。在茭白的發(fā)育過程中，保護(hù)酶類如SOD的活性存在明顯的變化，龍茭2號發(fā)育早期SOD活性較高、發(fā)育中期活性降低，發(fā)育后期SOD活性又有所升高，可能與茭白黑粉菌的侵染分布有關(guān)。茭白孕茭發(fā)育早期，黑粉菌成功侵染茭白植株，引發(fā)茭白植株產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，如活性氧暴發(fā)，茭白植株通過對保護(hù)酶活性的調(diào)控維持體內(nèi)正常生長所需的活性氧含量，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)育早期SOD活性較高；隨著茭白發(fā)育的進(jìn)行，黑粉菌在茭白莖部膨大的過程中伸展擴(kuò)散到莖部的各個部位，與茭白維持共生狀態(tài)，茭白植株應(yīng)激反應(yīng)降低，相關(guān)保護(hù)酶活性也隨之降低；到了發(fā)育后期，茭白莖部停止發(fā)育，莖部內(nèi)黑粉菌數(shù)量增多，再一次引發(fā)茭白植株的應(yīng)急防御反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)保護(hù)酶活性升高。由此可見，茭白植株相關(guān)保護(hù)酶的活性變化與黑粉菌侵染密切相關(guān)，對其開展進(jìn)一步研究有助于闡明茭白孕茭過程中茭白植株與黑粉菌的互作機(jī)制。

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