小鼠感染流感病毒后外周血IFN-α變化規(guī)律的研究

李艷，寧秋，韓德明，姚海虹，趙赫楠，趙麗輝

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 校醫(yī)院，長(zhǎng)春 130022；2.遼源職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥分院，遼源 136200；3.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

流感病毒與宿主的相互作用通常會(huì)產(chǎn)生宿主種間屏障作用抵御流感病毒的感染，導(dǎo)致流感病毒不能感染宿主。流感病毒感染宿主后，宿主表現(xiàn)出以呼吸器官損傷為主的病理過(guò)程，引起發(fā)病或死亡。病毒也可以在宿主體內(nèi)復(fù)制但不發(fā)病，使宿主產(chǎn)生天然性免疫或適應(yīng)性免疫，從而有效地抵御病毒的侵襲，因此宿主即使被病毒感染也不會(huì)表現(xiàn)其致病性，宿主體內(nèi)的各種細(xì)胞因子影響了流感病毒的致病性［1，2］。

干擾素（interferon，IFN）是一種糖蛋白，是一種由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。人們目前已發(fā)現(xiàn)有α、β、γ三種類型的干擾素，I型的干擾素包括α型（IFN-α）和β型干擾素（IFN-β），IFN-α是由白細(xì)胞產(chǎn)生的，IFN-β是由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的，而γ型干擾素（IFN-γ）是由免疫系統(tǒng)中的自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和T細(xì)胞產(chǎn)生的［3］。IFN-α通過(guò)調(diào)控免疫應(yīng)答來(lái)抑制病毒蛋白的合成，IFN-α和細(xì)胞膜上干擾素受體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)一系列的激活過(guò)程會(huì)誘導(dǎo)干擾素激活基因的轉(zhuǎn)錄，抑制病毒蛋白的合成，也可以通過(guò)激活促凋亡蛋白和細(xì)胞周期抑制蛋白產(chǎn)生抗病毒作用［4，5］。由干I型IFN-α/β參與的抗病毒感染天然免疫應(yīng)答是機(jī)體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的抵抗病毒入侵的主要防御機(jī)制之一，它在機(jī)體抗病毒侵染及誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面起著非常重要的作用［6］。處在流感病毒感染時(shí)期患者，最初在病毒感染的幾小時(shí)之內(nèi)即被誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α/β，識(shí)別的過(guò)程是RNA病毒和胞內(nèi)RIG-1受體和Toll樣受體（TLRs）識(shí)別、結(jié)合，啟動(dòng)了干擾素應(yīng)答反應(yīng)。RNA病毒侵染的是呼吸道上皮細(xì)胞，通過(guò)識(shí)別維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-1）胞內(nèi)受體，激活天然免疫系統(tǒng)和哺乳細(xì)胞內(nèi)抗病毒的干擾素通路，誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)，最終清除感染部位的病毒［7，8］。這些研究進(jìn)一步表明IFN-α/β在抗流感病毒感染、誘導(dǎo)天然免疫及適應(yīng)性免疫過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［9-11］。

綜上所述，為了進(jìn)一步研究干擾素在機(jī)體抗流感病毒的作用，實(shí)驗(yàn)利用普通流感病毒鼻滴感染小鼠，通過(guò)測(cè)定小鼠外周血中IFN-α含量的變化，來(lái)研究普通流感病毒感染小鼠過(guò)程中IFN-α的變化規(guī)律及IFN-α抗病毒的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研制新型通用流感疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器

取感染普通流感病毒的患者的血液（患者血液來(lái)自長(zhǎng)春理工大學(xué)校醫(yī)院），于冰箱4℃保存。6-8周齡Balb/c小鼠（購(gòu)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。乙醚；1640培養(yǎng)基；無(wú)血清的DMEM液；IFN-α試劑盒；PBS緩沖液；酒精，聚肌胞Poly（I：C）（主要試劑購(gòu)買(mǎi)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）。超凈工作臺(tái)（FromaScientific）；離心機(jī)；酶標(biāo)儀；冰箱；濾菌器；高壓鍋；離心管；三孔電熱恒溫水槽（儀器購(gòu)買(mǎi)上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)

將小鼠隨機(jī)分為五組，其中設(shè)置兩組對(duì)照組，分別為空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，剩下的三組分別為普通流感病毒的三個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組，記為C1組，C2組，C3組。每組小鼠8只，一共40只。小鼠在相同飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。

各組小鼠用乙醚輕度麻醉后，空白對(duì)照組滴鼻無(wú)血清的DMEM液，陽(yáng)性對(duì)照組滴鼻Poly（I：C）試劑，其余各組分別滴鼻含普通流感病毒的血液，設(shè)不同的濃度梯度。

1.2.2 小鼠血清收集與測(cè)定

小鼠感染 1d，2d，4d，6d后，斷尾取血，離心3000r/min，15min，收集血清，血清置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

具體步驟：

（1）設(shè)置陰性、陽(yáng)性、標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)驗(yàn)孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品5μL；

（2）陰性、陽(yáng)性和實(shí)驗(yàn)孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

（3）陰性、陽(yáng)性孔和實(shí)驗(yàn)孔分別加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗原）100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min；

（4）棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；

（5）每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

（6）每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

2 結(jié)果分析

普通流感病毒通過(guò)滴鼻感染小鼠，經(jīng)過(guò)一周的觀察，感染病毒的小鼠前三天精神萎靡，活動(dòng)量少，之后活動(dòng)量逐漸增加，進(jìn)食量也有所增加，精神狀態(tài)良好，恢復(fù)正常小鼠表現(xiàn)狀態(tài)。小鼠滴鼻普通流感病毒1d，2d，4d，6d摘除眼球靜脈取血，離心取上清液，ELISA雙抗體夾心檢測(cè)法檢測(cè)血液IFN-α。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)干擾素ELISA試劑盒的要求，需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 干擾素ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)樣品的OD值

由標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可知，樣品的OD值與樣品濃度成正比。圖中標(biāo)注了趨勢(shì)線的方程以及方差值R2=0.9824，P＜0.01，數(shù)據(jù)可信，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程可以推算出檢測(cè)樣品中IFN-α的含量。

2.2 感染病毒的小鼠血清中IFN-α含量的檢測(cè)

圖2 小鼠體內(nèi)IFN-α的變化（▲為陽(yáng)性，■實(shí)驗(yàn)組，◆陰性）

實(shí)驗(yàn)組小鼠分別滴鼻流感病毒為12.5mg/mL、25mg/mL、37.5mg/mL，1d，2d，4d，6d檢測(cè)小鼠血清中IFN-α的含量。由圖可以看出，陰性對(duì)照組中，小鼠體內(nèi)的干擾素含量保持平衡，而實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)隨著感染時(shí)間的增加而出現(xiàn)一定的變化規(guī)律。在感染的2d，小鼠血清中的IFN-α含量達(dá)到最大值，4d時(shí)觀察，血清中的IFN-α含量下降，到6d時(shí)，血清中的IFN-α含量逐漸回落到一定的水平。

陰性組滴鼻小鼠不同濃度的無(wú)血清培養(yǎng)液后，小鼠血液中的IFN-α的含量無(wú)明顯的變化，說(shuō)明DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)入小鼠體內(nèi)后不會(huì)引起機(jī)體防御系統(tǒng)的應(yīng)答，而陽(yáng)性藥物Poly（I：C）滴鼻進(jìn)入小鼠體內(nèi)后激活了機(jī)體防御系統(tǒng)產(chǎn)生了干擾素。Poly（I：C）導(dǎo)致小鼠血清中IFN-α含量變化隨著時(shí)間的增加而增加，到2小時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸回落，第4天血液中的IFN-α含量逐漸降低，第6天血清中IFN-α的含量保持平衡水平。

3 討論

流感病毒感染小鼠后的臨床癥狀在很大程度上取決于病毒復(fù)制與宿主防御反應(yīng)的平衡關(guān)系。流感病毒逃避宿主免疫應(yīng)答的能力對(duì)其致病力是至關(guān)重要的［12］。宿主細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），迅速啟動(dòng)了由干擾素和相關(guān)的細(xì)胞因子介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，阻止了病毒的侵染［13］。通過(guò)分泌I型IFN-α并和受體結(jié)合，利用激活的JAK/STAT途徑活化干擾素刺激因子產(chǎn)生抗病毒作用。目前，人們?cè)趯?duì)流感病毒的致病性進(jìn)行研究的同時(shí)，也在研究宿主自身的抗病毒的作用，尤其對(duì)流行的高致病性流感病毒感染小鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究，同時(shí)更多關(guān)注的是自身細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子的抗病毒作用。由于細(xì)胞因子能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程和發(fā)展趨勢(shì)，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過(guò)程中、促進(jìn)免疫細(xì)胞活化和清除病毒方面的作用非常重要。所以，為了研究I型IFN-α在抗病毒中的作用，實(shí)驗(yàn)選擇感染流感病毒第三天的患者的血液，取血清給小鼠進(jìn)行滴鼻實(shí)驗(yàn)。在低于12.5μL血清滴鼻實(shí)驗(yàn)時(shí)，干擾素IFN-α的變化的規(guī)律不明顯，高于14μL小鼠死亡過(guò)半，為此選擇12.5mg/mL、25mg/mL、37.5mg/mL三個(gè)濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)滴鼻實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行觀察，分別在1d，2d，4d，6d斷尾取血，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第二天血清中的IFN-α含量達(dá)到最大值，然后開(kāi)始下降，最后趨于平穩(wěn)的表達(dá)水平，如圖2所示。研究還發(fā)現(xiàn)不同量的普通流感病毒的感染小鼠機(jī)體后，檢測(cè)小鼠機(jī)體感染不同時(shí)間后血液中IFN-α含量，同一劑量的普通流感病毒感染小鼠，小鼠血液中IFN-α含量隨著時(shí)間的變化而變化，顯現(xiàn)出隨著時(shí)間增加IFN-α含量先增加再降低，然后維持在一定水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明普通流感病毒的感染會(huì)引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，促使免疫細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素通過(guò)細(xì)胞表面受體產(chǎn)生抗病毒的蛋白抑制了病毒的復(fù)制，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研制新型通用流感疫苗奠定實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

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