奶牛副結(jié)核病的血清學(xué)調(diào)查與防控措施

瞿慧方桂明顧曉李東堯劉淡寧王恒安

（1，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 200240；2，上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 201499）

奶牛副結(jié)核病的血清學(xué)調(diào)查與防控措施

瞿慧1.2方桂明2顧曉2李東堯2劉淡寧2王恒安1*

（1，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 200240；2，上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 201499）

副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌引起的以牛、羊等反芻獸的慢性消化道疾病。以頑固性腹瀉、漸進(jìn)性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺襞為特征。本文采用副結(jié)核酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)方法進(jìn)行了調(diào)查分析。結(jié)果表明：在430份樣品中，副結(jié)核抗體陰性414份，副結(jié)核抗體陽(yáng)性16份，陽(yáng)性率3.7%。本次副結(jié)核病的血清學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)與分析為本病防控提供了科學(xué)依據(jù)。

奶牛；副結(jié)核??；血清學(xué)調(diào)查；防控；奉賢區(qū)

副結(jié)核病 （Paratuberculosis）是由副結(jié)核分枝桿菌引起的以牛、羊等反芻獸的慢性消化道疾病，屬于禽分枝桿菌副結(jié)核亞種，是一種細(xì)長(zhǎng)桿菌。Johne于1895年首先發(fā)現(xiàn)本病，故又稱為約內(nèi)氏病 （Johne病）。以頑固性腹瀉、漸進(jìn)性消瘦、腸粘膜增厚并形成皺襞為特征。通常動(dòng)物在出生的第一年通過(guò)采食被感染動(dòng)物糞便污染的飼料感染本病，副結(jié)核的感染是一個(gè)很漫長(zhǎng)的過(guò)程，潛伏期通常為3～5年，最早4個(gè)月的犢牛就可以表現(xiàn)出臨床癥狀，長(zhǎng)的可達(dá)15年[1]。OIE將其列為B類疫病。

本病廣泛流行于世界各國(guó)，如美國(guó)、澳大利亞、日本、英國(guó)等國(guó)家，給全球范圍內(nèi)的畜牧業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。有報(bào)道副結(jié)核病感染會(huì)造成整個(gè)牛群每頭奶牛超過(guò)200美元的損失，損失主要是產(chǎn)奶量的降低。副結(jié)核病對(duì)整個(gè)奶牛產(chǎn)業(yè)的損失估計(jì)為每年2～2.5億美元。本病沒(méi)有有效的治療方法，感染動(dòng)物最后會(huì)因?yàn)榇瞬∷劳?，死亡率通常?～10%。根除本病的唯一方法就是檢出、隔離或者淘汰[2]。我國(guó)最早發(fā)現(xiàn)牛副結(jié)核病是在1955年內(nèi)蒙古自治區(qū)的一個(gè)牧場(chǎng)，此后黑龍江、貴州、河北等多個(gè)地區(qū)相繼報(bào)告此病，幾乎遍及我國(guó)大部分北方區(qū)域。隨著我國(guó)國(guó)民生活水平的不斷提高，對(duì)奶制品的需求也不斷隨之增長(zhǎng)，急需大量高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)奶牛，造成全國(guó)甚至世界奶牛大流通，為本病的傳播提供了便捷。上海市奉賢區(qū)是上海市政府確定的適度養(yǎng)殖區(qū)，目前轄區(qū)內(nèi)有規(guī)模化奶 （種）牛場(chǎng)19家，總存欄量達(dá)11000多頭，是上海的奶牛養(yǎng)殖大區(qū)。結(jié)合近幾年該區(qū)奶牛結(jié)核病的防控工作，我們分析結(jié)核病檢測(cè)結(jié)果得出，在牛結(jié)核的檢疫中存在禽結(jié)核或副結(jié)核的干擾。同時(shí)，該區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)存在不同比例以奶牛腹瀉、消瘦為主要癥狀的病例發(fā)生。為進(jìn)一步掌握該區(qū)奶牛副結(jié)核病的流行情況，我們開(kāi)展了本次奶牛副結(jié)核病的調(diào)查，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，旨為本區(qū)奶牛副結(jié)核病防控提供科學(xué)依據(jù)，供廣大同行參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對(duì)奉賢區(qū)19家奶牛場(chǎng)進(jìn)行血樣品采集，每頭牛尾根靜脈無(wú)菌采血5ml，每家牛場(chǎng)根據(jù)飼養(yǎng)規(guī)模大小采集樣品20或30份，其中育成牛10或15份，成乳牛10或15份，共采集血樣品430份。每場(chǎng)編號(hào)前10或15份為育成牛樣品，后10或15份為成乳牛樣品。在成乳牛樣品中，每場(chǎng)最后5份樣品有目的性挑選有腹瀉、消瘦、被毛長(zhǎng)或者不發(fā)情癥狀的成乳牛，其余樣品為隨機(jī)采集。所有樣品經(jīng)離心后取上清液移至離心管內(nèi)，編號(hào)后放入冰箱內(nèi)-20℃保存，待檢。

1.2 牛副結(jié)核抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISA）

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

用副結(jié)核抗原包被微量反應(yīng)板。為了結(jié)合非特異性的抗體，樣品首先與草分枝桿菌提取物預(yù)孵育。將預(yù)孵育的樣品加入抗原包被的反應(yīng)板進(jìn)行孵育。檢測(cè)樣品在包被孔內(nèi)孵育后，副結(jié)核特異性抗體會(huì)形成抗原抗體免疫復(fù)合物。將未結(jié)合的材料洗去，加入抗反芻動(dòng)物酶標(biāo)抗體，它會(huì)與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。洗掉未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加入底物液。在酶的作用下，底物被氧化成藍(lán)色化合物。加入終止液后，又變成黃色。隨后的顏色深淺與檢測(cè)樣品中存在的副結(jié)核抗體成正比。診斷相關(guān)結(jié)果通過(guò)樣品的光密度值與陽(yáng)性對(duì)照光密度的平均值相比較而得出。

1.2.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

陰性：S/P%≤45%，判定為 “—”。

可疑：S/P%大于45%且小于55%，判定為 “±”。

陽(yáng)性：S/P%≥55%，判定為 “+”。

1.2.3 試劑盒生產(chǎn)單位

北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司，批號(hào)：4109F。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛副結(jié)核病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

本次調(diào)查共收集19家規(guī)?；膛?chǎng)樣品430份，根據(jù)檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)，在430份樣品中，副結(jié)核抗體判定為陰性的有414份，副結(jié)核抗體判定為陽(yáng)性的有16份，陽(yáng)性率3.7%。

檢測(cè)結(jié)果顯示，在本次調(diào)查中有11家奶牛場(chǎng)檢測(cè)到了陽(yáng)性樣品，占牛場(chǎng)數(shù)的57.80% （詳見(jiàn)表1）。

2.2 成乳牛副結(jié)核病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.2.1 有癥狀組成乳牛調(diào)查結(jié)果分析

本次采樣過(guò)程中，有針對(duì)性的從每家奶牛場(chǎng)中選擇5頭有腹瀉、消瘦、被毛長(zhǎng)或者不發(fā)情等癥狀的奶牛作為檢測(cè)對(duì)象，共計(jì)95頭來(lái)檢測(cè)是否感染牛副結(jié)核病。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，在這95份樣品中，牛副結(jié)核抗體判定為陰性的有88份，牛副結(jié)核抗體判定為陽(yáng)性的有7份，陽(yáng)性率為7.4%。其結(jié)果表明在有腹瀉、消瘦等臨床癥狀的奶牛當(dāng)中有較高一部分為牛副結(jié)核病感染，或者與其他疾病混合感染 （詳見(jiàn)表2）。

2.2.2 隨機(jī)組成乳牛血清學(xué)調(diào)查結(jié)果分析

本次調(diào)查除針對(duì)性的采集上述95份成乳牛樣品，其余120份樣品為隨機(jī)采集。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，牛副結(jié)核病抗體判定為陰性的有117份，副結(jié)核病抗體判定為陽(yáng)性的有3份，副結(jié)核病抗體陽(yáng)性率為2.5%。說(shuō)明存在副結(jié)核病的隱性或慢性感染 （詳見(jiàn)表2）。

2.3 育成牛副結(jié)核病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

本次調(diào)查共采集育成牛樣品215份，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，牛副結(jié)核病抗體判定為陰性的有209份，牛副結(jié)核病抗體判定為陽(yáng)性的有6份，陽(yáng)性率為2.8%；其中有5個(gè)牛場(chǎng)存在育成牛副結(jié)核抗體陽(yáng)性，占牛場(chǎng)數(shù)的26.3% （見(jiàn)表1）。

表1 牛副結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)果 （單位：頭、%）

3 討論

（1）王永康等[3]對(duì)上海的1250份奶牛待檢血清進(jìn)行了副結(jié)核病ELISA檢測(cè)，共檢出陽(yáng)性9份，陽(yáng)性率0.72%。14年后，我們通過(guò)對(duì)該區(qū)奶牛副結(jié)核病的調(diào)查，ELISA檢測(cè)副結(jié)核病陽(yáng)性率3.7%，說(shuō)明該區(qū)奶牛副結(jié)核發(fā)病率有所上升，這與該區(qū)部分牧場(chǎng)反映有腹瀉、消瘦等癥狀病牛存在的臨床調(diào)查情況一致。也可能與近幾年奶牛交易大流通廣等因素有關(guān)，應(yīng)引起高度重視。

表2 成乳?？贵w檢測(cè)結(jié)果 （單位：頭、%）

（2）由于病牛往往在感染后期才出現(xiàn)臨床癥狀，因此藥物治療常無(wú)效。盡管在體外試驗(yàn)中，副結(jié)核分枝桿菌對(duì)多種抗結(jié)核類藥物敏感，但用于治療往往效果不明顯，或者僅能緩解癥狀，不能抑制其向外排菌。

（3）對(duì)于牛結(jié)核檢疫中檢出的可疑牛，常常在復(fù)檢時(shí)，給牛同時(shí)注射牛型和禽型兩種菌素作鑒別診斷，這已是當(dāng)前奶牛結(jié)核檢疫中所普遍采用的方法。2013年，我們?cè)趯?duì)全區(qū)奶牛結(jié)核檢疫中檢出的670頭可疑牛，采用牛型與禽型比較變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果有10頭綜合判斷為禽結(jié)核陽(yáng)性牛。由于禽結(jié)核菌與副結(jié)核菌有較多的類屬抗原，所以各國(guó)也會(huì)采用禽結(jié)核菌素來(lái)檢疫副結(jié)核病。王鐵等[4]（1993）采用副結(jié)核弱毒苗對(duì)40頭犢牛出生一周內(nèi)皮下接種，7d后用禽型結(jié)核菌素進(jìn)行檢疫，全部為陽(yáng)性。說(shuō)明該區(qū)奶牛結(jié)核病復(fù)檢鑒別診斷出的禽結(jié)核有較大比例是副結(jié)核病，應(yīng)根據(jù)牛只健康情況給予隔離或者淘汰。

（4）預(yù)防本病重在加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，特別是對(duì)犢牛更應(yīng)注意給以足夠的營(yíng)養(yǎng)，以增強(qiáng)其抗病力。不要從疫區(qū)引進(jìn)牛只，如已引進(jìn)，則必須進(jìn)行檢測(cè)，確診健康時(shí)，方可混群。

（5）被病牛污染過(guò)的牛舍、走道、飼槽、用具及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)等，要用生石灰、來(lái)蘇兒、苛性鈉、漂白粉、石炭酸等消毒液進(jìn)行噴霧、浸泡或沖洗。糞便應(yīng)堆積高溫發(fā)酵后作肥料用。

（6）關(guān)于本病的人工免疫，目前尚有爭(zhēng)論。據(jù)報(bào)道，我國(guó)有的單位從英國(guó)引進(jìn)副結(jié)核弱毒株，研制出副結(jié)核弱毒疫苗，在有副結(jié)核 （無(wú)結(jié)核病）的牛場(chǎng)試驗(yàn)，免疫期可達(dá)48個(gè)月。我國(guó)吉林省獸醫(yī)科學(xué)研究所用副結(jié)核滅活苗對(duì)污染牛群新生犢牛在7日內(nèi)接種，同時(shí)采取以下綜合措施：①犢牛生后立即與母牛分開(kāi)，人工飼喂牛乳。②犢牛所吃的牛奶經(jīng)過(guò)消毒。③犢牛專人飼養(yǎng)，舍內(nèi)經(jīng)常清掃并消毒。④對(duì)成年牛每年定期檢疫，檢出陽(yáng)性牛應(yīng)隔離飼養(yǎng)，一旦發(fā)現(xiàn)開(kāi)放牛立刻撲殺，并對(duì)其可能污染的場(chǎng)所、用具進(jìn)行徹底消毒。他們用這樣方法經(jīng)7年時(shí)間使某個(gè)牛場(chǎng)的副結(jié)核檢出率由原來(lái)的 8.83%降至0.34%[4]。

[1]Chiodini R.J,et al.The Cornell,1984,74（3）.

[2]陸承平主編.獸醫(yī)微生物學(xué)（第三版）,中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001:331-339.

[3]王永康,等.上海市奶牛副結(jié)核病的血清學(xué)調(diào)查[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2000（2）:24.

[4]王鐵,等.牛接種副結(jié)核病弱毒苗對(duì)禽型結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,1993（5）:20-21.

*為通訊作者。