PHA高產菌株發(fā)酵條件優(yōu)化研究

王 悅，孫金旭，朱會霞

?

PHA高產菌株發(fā)酵條件優(yōu)化研究

王 悅，孫金旭，朱會霞

(衡水學院 生命科學學院，河北 衡水 053000)

以篩選出的生物環(huán)保材料PHA高產菌株SJ-9為初始菌株，對其發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以丁酸鈉、碳氮比例、pH、溫度、轉速、裝液量、誤差7種因素，利用L18(37)正交試驗設計進行條件優(yōu)化，經實驗得出適宜的發(fā)酵條件組合為：丁酸鈉為2 g/L，碳氮比例為40，pH為7.5，溫度為26℃，轉速為150 r/min，裝液量200mL/L．此條件下，PHA產量為3.31g/L．相對其未優(yōu)化條件產量提高46.5 %．

PHA；發(fā)酵；優(yōu)化；正交實驗

傳統(tǒng)的高分子材料大多來源于石油化工，其大規(guī)模的生產加速了不可再生資源的利用，及其耐耗性也造成日趨嚴重的環(huán)境危害．聚烴基脂肪酸酯(PHA)作為一種新型的高分子材料，它的合成原料為糖、脂肪酸等可再生資源，并且具有生物可降解性和生物可相容性等獨特優(yōu)點．這些特性可以有效地緩解資源緊張以及環(huán)境污染的現(xiàn)狀[1]．

因此近幾十年來，PHA的研究被各國所重視，其制品被應用于塑料、醫(yī)學等各種領域[2-3]．其中，微生物大規(guī)模發(fā)酵法是獲取PHA的主要生物途徑，在國內外均有大量研究，現(xiàn)階段限制PHA發(fā)展應用的主要因素為優(yōu)勢菌種少、PHA產量過低、成本過高．因此，篩選PHA高產菌株以提高PHA產量勢在必行．本研究就實驗室現(xiàn)有的已篩選出的PHA高產菌株SJ-9[4]基礎上，對其培養(yǎng)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期提高PHA產量．

1 材料與實驗方法

1.1 PHA高效生產菌株SJ-9

衡水學院微生物實驗室篩選保藏．

1.2 實驗儀器

氣相色譜儀(Agilent GC7890)；紅外光譜儀(AVTAR36O)美國熱電尼高力公司；恒溫搖床(ZHWY-2112B)上海智誠分析儀器制造有限公司．

1.3 PHA提取與測定

氯仿提取與氣相色譜分析測定[4]．

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗設計

為優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的條件，選取一定量的高產菌SJ-9采用正交實驗法，選用對生產PHA的微生物合成能產生影響的碳源、碳氮比、初始pH值、培養(yǎng)溫度、轉速、裝液量為試驗因素，各取3水平因素不同含量，以PHA產量(g/L)為參考指標，進行L18(37)正交實驗安排，具體設計見表1．

表1 因素位級表

2 結果分析

對以PHA產量(g/L)為目的產物進行正交實驗結果以及方差分析，具體實驗數(shù)據(jù)見表2、表3．

表2 正交實驗設計及結果

表3 正交實驗方差分析表

注：* 表示具有顯著性.

由正交實驗結果可以得出，極差的大小順序為B﹥D﹥E﹥A﹥F﹥C，即影響PHA產率的7種因素的主次依次是碳氮比﹥溫度﹥轉速﹥丁酸鈉﹥裝液量﹥pH，其中碳氮比對PHA產率的影響最大，初始pH的濃度影響最小．比較3個因素不同水平下的綜合，發(fā)現(xiàn)A2、B3、C3、D1、E2、F2、G2條件下PHA的產量最高，產量為3.31 g/L．

由方差分析結果可以得出碳氮比與溫度的比值大于臨界值19，分別為76.59與22.936，表明碳氮比與溫度對PHA的產率具有顯著性，并且各因素間的重復性差異極其顯著，說明實驗數(shù)據(jù)可信．方差分析顯示各因素對PHA的產率均有影響．

已有的研究得出，PHA顆粒數(shù)目在細胞積累初期就已固定，即PHA的積累與菌體量是同步進行、同步完成的[3]．碳源與氮源是合成細胞的基礎物質，本次實驗表明，碳氮比對PHA的產率具有顯著性，也就進一步驗證底物對合成PHA的重要性．此次實驗的最佳條件是碳氮比為最大40時，也驗證了，合適的限氮條件可以增加PHA在細胞中的積累[5-6]．在菌種的培養(yǎng)條件中，溫度為最主要的一種，選擇合適的溫度不僅可以加速酶的活性，而且可以使菌種維持穩(wěn)定的生長狀態(tài)，溫度過高或多低，都會影響酶的活性，甚至會殺死菌細胞．

在實驗范圍內，PHA高產菌株SJ-9的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：丁酸鈉為2 g/L，碳氮比例為40，pH 為 7.5，溫度為26 ℃，轉速為150 r/min，裝液量200 mL/L．PHA產量為3.31 g/L．

3 結論

本實驗以PHA產量為指標對SJ-9菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件利用L18(37)正交實驗設計進行條件優(yōu)化，經實驗得出，適宜的發(fā)酵條件組合為：丁酸鈉為2 g/L，碳氮比例為40，pH 為 7.5，溫度為26 ℃，轉速為150 r/min，裝液量200 mL/L．此條件下，PHA產量為3.31 g/L．相對未優(yōu)化條件下的產量提高46.5 %．其中，碳氮比對PHA產率的影響最大，同時溫度對PHA的產率的影響也具有顯著性．

[1] 陳國強.生物高分子材料聚羥基脂肪酸脂(PHA)開發(fā)現(xiàn)狀及產業(yè)化前景分析[J].化工新型材料,2010,38(10):1-7.

[2] 張瑞和.我國全降解塑料產業(yè)化的進程[J].中國環(huán)保產業(yè),2005(1):39-41.

[3] ANDERSON A J, DAWES E A. Ocurrene, metabolism, metabolic roll and industrial uses of bacterial polyhy droxyalkanoates[J]. Microbilol,1990,54:450-472.

[4] 朱會霞.PHA生產菌株的篩選及生長特性研究[J].China Brewing,2011,236(11):54-57.

[5] 陳志強,田婷,溫沁雪,等.限氮和限磷對活性污泥合成聚羥基烷酸的影響[J].環(huán)境工程學報,2010(4):771-775.

[6] MADISON L L, HUISMAN G W. Metabolic engineering of poly (3- hydroxyalkanates): from DNA to plastic [J]. Microbiol Mol Biol Rev,1999,63:21- 53.

Optimization of Fermentation Conditions for High-producing Strain of PHA

WANG Yue, SUN Jin-xu, ZHU Hui-xia

(College of Life Science, Hengshui University, Hengshui, Hebei 053000, China)

With the selected high-producing strain SJ-9 of the biological environmental protection material PHA as the initial strain, the fermentation and culture conditions are optimized with L18(37) orthogonal experiment, in terms of sodium butyrate, PH, temperature, rotate speed, loaded liquid and error. The experiment shows that the appropriate fermentation condition is got when sodium butyrate is 2 g/L, the ratio of carbon and nitrogen is 40, pH is 7.5, temperature is 26 ℃, rotate speed is 150 r/min and the loaded liquid is 200 mL/L. Under this optimized condition, the PHA production is 3.31 g/L which is increased by 46.5 % when compared to former conditions.

PHA; fermentation; optimization; orthogonal experiment

(責任編校：李建明 英文校對：李玉玲)

10.3969/j.issn.1673-2065.2015.01.010

Q93-331

A

1673-2065(2015)01-0033-03

2014-09-22

河北省科技廳資助課題 (10215522)

王 悅(1985-)，女，河北衡水人，衡水學院生命科學學院助教，工學碩士；

孫金旭(1975-)，男，河北景縣人，衡水學院生命科學學院副教授，工學博士．