Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性研究

劉慧梅，顏學(xué)兵

1.徐州醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院（徐州 221000）；2.徐州市傳染病醫(yī)院 結(jié)核科（徐州 221000）；3.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科（徐州 221000）

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌（M.tubercutosis，MTB）感染所引起的重大傳染性疾病。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病嚴(yán)重流行國(guó)家之一，同時(shí)也是27個(gè)耐多藥結(jié)核病嚴(yán)重流行國(guó)家之一［1］。早期快速診斷結(jié)核病是控制結(jié)核疫情的重要手段，傳統(tǒng)診斷結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室金標(biāo)準(zhǔn)為MTB培養(yǎng)和抗酸染色法，但MTB培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)細(xì)菌要求高，活菌不易獲?。?－3］；抗酸染色法雖快速、經(jīng)濟(jì)，但靈敏度較低［4－5］，因此有必要尋求一種快速診斷結(jié)核病的新手段。隨著實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)不斷發(fā)展，利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)（Xpert MTB/RIF）逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍關(guān)注，國(guó)外研究［6］表明，Xpert系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、診斷價(jià)值較高。本研究利用該技術(shù)對(duì)138例結(jié)核病患者進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年10月至2015年2月于徐州市傳染病醫(yī)院就診的151例可疑結(jié)核患者，按照中華結(jié)核病診治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，確診結(jié)核138例，其中兒童結(jié)核28例，成人結(jié)核110例；肺結(jié)核112例，肺外結(jié)核26例（包括結(jié)核性胸膜炎12例，結(jié)核性腹膜炎8例，結(jié)核性腦膜炎2例，淋巴結(jié)核1例，腎結(jié)核2例，輸卵管結(jié)核1例）；男85例，女53例，年齡（42.1±18.2）歲。非結(jié)核13例，其中肺炎7例，非結(jié)核分枝桿菌病3例，惡性胸腔積液2例，肺癌1例；男6例，女7例；年齡（42.9±8.1）歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本留取 肺結(jié)核、肺炎、肺癌以及非分枝桿菌病患者收集痰液標(biāo)本，結(jié)核性胸膜炎、惡性胸腔積液患者收集胸腔積液標(biāo)本，結(jié)核性腹膜炎收集腹腔積液標(biāo)本，淋巴結(jié)核收集膿液標(biāo)本，輸卵管結(jié)核收集盆腔積液標(biāo)本，腎結(jié)核收集尿液標(biāo)本，結(jié)核性腦膜炎收集腦脊液標(biāo)本。每個(gè)患者標(biāo)本一式3份，分別用于 MTB培養(yǎng)、涂片檢查和 Xpert MTB/RIF檢測(cè)。

1.2.2 痰培養(yǎng)、涂片鏡檢 按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)室檢查規(guī)程進(jìn)行［7］。

1.2.3 Xpert檢測(cè) 取1mL標(biāo)本置于有螺旋蓋的前處理器中，然后以1∶2的比例，往標(biāo)本中加入處理液，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30s，室溫靜置15min，使標(biāo)本充分液化。再將混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)盒中，將反應(yīng)試劑盒放入Gene Xpert儀器中，按說明書進(jìn)行檢測(cè)，約2h即可讀取結(jié)果。結(jié)果判斷依照探針的循環(huán)閾值（Ct值），當(dāng)內(nèi)對(duì)照探針Ct值≤38為陽性，反之則無效（提示標(biāo)本的DNA提取不合格或含有PCR抑制物）。5個(gè)探針中至少2個(gè)探針Ct值≤38即為檢測(cè)到MTB，可進(jìn)一步按照Ct值對(duì)MTB進(jìn)行半定量：Ct值＜16為高含量，16～22為中等含量，22～28為低含量，＞28為極低含量。檢測(cè)利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB特異性分子信標(biāo)早期Ct值和晚期Ct值之差，即△Ct值。系統(tǒng)設(shè)置的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：△Ct≥3.5，提示對(duì)利福平耐藥；△Ct＜3.5，提示對(duì)利福平敏感。由于終止循環(huán)數(shù)為38個(gè)循環(huán)，因此當(dāng)早期探針Ct值＞34.5或晚期探針Ct值＞38時(shí)，利福平耐藥結(jié)果為不確定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 臨床分離MTB新鮮培養(yǎng)液，磨菌，制備成1mg/mL菌懸液，稀釋至適當(dāng)濃度，接種至含藥培養(yǎng)基表面，應(yīng)注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基表面。接種后的培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，4周后報(bào)道結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件計(jì)算Xpert系統(tǒng)檢測(cè)MTB的敏感度和特異度，并作Kappa分析，K≥0.4表示一致性好。

2 結(jié)果

2.1 Xpert MTB試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

采用Xpert MTB試驗(yàn)檢測(cè)151例可疑結(jié)核病患者，其中涂陽39例，涂陰112例。以液體變色培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB試驗(yàn)檢測(cè)涂陽患者 MTB 靈敏度為86.2%（25/29），特異度為70.0%（7/10）；檢測(cè)涂陰患者 MTB靈敏度為0.0%（0/4），特異度為80.6%（87/108）；全部患者檢測(cè)的靈敏度為75.8%（25/33），特異度為79.7%（94/118）（表1）。對(duì)Xpert MTB試驗(yàn)和液體培養(yǎng)進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，K＝0.472，兩者檢測(cè)結(jié)果一致性好。

表1 Xpert MTB檢測(cè)MTB結(jié)果（例）

2.2 Xpert RIF檢測(cè)結(jié)果

33例培養(yǎng)陽性標(biāo)本中，比例法檢測(cè)出利福平耐藥菌5株，耐藥率為15.2%（5/33）。以比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥的靈敏度為80.0%（4/5），特異度為89.3%（25/28）（表2）。對(duì)Xpert RIF試驗(yàn)和比例法藥敏試驗(yàn)進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，K＝0.595，兩種檢測(cè)結(jié)果一致性好。

表2 Xpert RIF檢測(cè)結(jié)果（例）

3 討論

Xpert MTB/RIF核酸檢測(cè)技術(shù)采用Gene Xpert檢測(cè)系統(tǒng)，是一種半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR體外診斷技術(shù)，以利福平耐藥相關(guān)rpoB基因?yàn)榘谢?，可?h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)MTB和利福平耐藥情況［8］。由于大多數(shù)利福平耐藥菌株都對(duì)異煙肼耐藥，因此利福平耐藥情況在一定程度上能作為耐多藥結(jié)核病的檢測(cè)指標(biāo)［9］。

本研究結(jié)果顯示，以液體變色培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)MTB靈敏度為75.8%，特異度為79.7%。以MTB培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Boehme等［10］和伊慧霞等［11］用Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)MTB的敏感度和特異度均達(dá)到90%以上，明顯高于本研究，可能與以下原因有關(guān)：1）Boehme與伊慧霞等研究病例均為成人，而本研究由于樣本量較少，一并加入兒童病例，且兒童病例占患者總數(shù)的20%左右。國(guó)外Nicol等［12］對(duì)兒童結(jié)核患者行Xpert試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其靈敏度和特異度明顯低于成人；2）Boehme等的試驗(yàn)結(jié)果為重復(fù)試驗(yàn)兩次以上后記錄的最后檢測(cè)結(jié)果，本研究?jī)H檢測(cè)1次，而Xpert MTB/RIF檢測(cè)次數(shù)的增加會(huì)在一定程度上加大其檢測(cè)MTB的靈敏度和特異度［6］。本研究MTB培養(yǎng)陽性率較低，其原因可能是由于本研究樣本量較少（僅150余例）以及標(biāo)本留取種類較多，其中胸腔積液和腹腔積液很難檢測(cè)出MTB。

本研究對(duì)涂片陽性患者診斷靈敏度為86.2%，而對(duì)培養(yǎng)陽性、涂片陰性的4例標(biāo)本行Xpert MTB/RIF檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)MTB感染，其原因可能是培養(yǎng)涂陰標(biāo)本過少以及Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)次數(shù)少，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。國(guó)外已經(jīng)在多個(gè)地區(qū)開展Xpert MTB/RIF試驗(yàn)診斷結(jié)核病臨床價(jià)值的研究，對(duì)涂片陽性標(biāo)本的敏感度為98%～100%，涂片陰性標(biāo)本的敏感度為57%～83%［13－14］。上述研究結(jié)果均表明，Xpert MTB/RIF試驗(yàn)對(duì)涂片陽性標(biāo)本的診斷靈敏度明顯高于涂片陰性標(biāo)本，本研究也支持上述結(jié)論。

Boehme等［10］研究發(fā)現(xiàn)，以比例法藥敏試驗(yàn)作為檢測(cè)利福平耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF試驗(yàn)?zāi)軌驕?zhǔn)確鑒定出97.6%的利福平耐藥菌株，同時(shí)正確排除98.1%的利福平敏感菌株。張治國(guó)等［15］研究結(jié)果表明，Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為89.1%，特異度為96.3%，均高于本研究，其原因可能是部分標(biāo)本中MTB含量較低，從而影響Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥的準(zhǔn)確性。Lawn等［16］研究發(fā)現(xiàn) Xpert MTB/RIF試驗(yàn)過程中探針B循環(huán)閾值存在延遲現(xiàn)象，探針B異?？赡軐?dǎo)致Xpert MTB/RIF試驗(yàn)出現(xiàn)利福平耐藥假陽性結(jié)果。因此世界衛(wèi)生組織建議，臨床應(yīng)用Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)出利福平耐藥后，在進(jìn)行藥物治療的同時(shí)，需行藥敏試驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性。

雖然Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)成本較高，但與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)相比，該方法具有較高的靈敏度和特異度，且操作簡(jiǎn)單，操作人員經(jīng)簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可獨(dú)立完成整個(gè)操作流程，短時(shí)間內(nèi)即可獲取檢測(cè)結(jié)果，不會(huì)延誤初診患者的最佳治療時(shí)間。尤其在落后地區(qū)或基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，很多先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)難以開展，Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)在上述地區(qū)具有一定的應(yīng)用前景。

［1］嚴(yán)永華，楊春梅，徐濤，等.四川結(jié)核病患者結(jié)核分析桿菌耐藥狀況分析［J］.成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，7（1）：58－60.

［2］王永忠，柳龍根，張宏宇，等.結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］.江蘇醫(yī)藥，2011，37（23）：2820－2822.

［3］鄭強(qiáng)，李朝金，茍莉，等.多種肺結(jié)核臨床實(shí)驗(yàn)室診斷方法的比較分析［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（21）：2941－2942.

［4］雷云.熒光PCR診斷肺結(jié)核的臨床應(yīng)用研究［J］.臨床肺科雜志，2014，19（7）：1278－1279.

［5］張玉平，丁顯平，張麗嬡，等.T－SPOT.TB、痰涂片和 TBDNA檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中的比較研究［J］.成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，8（1）：49－51.

［6］夏輝，趙雁林.Xpert MTB/RIF在我國(guó)的應(yīng)用前景［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（23）：3799－3800.

［7］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程［M］.北京：中國(guó)教育文化出版社，2006.

［8］尹青琴，申阿東.Xpert MTB/RIF試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的研究現(xiàn)狀［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35（5）：363－365.

［9］Mokrousov I，Otten T，Vyshnevskiy B，et al.Allele－specific rpoB PCR assays for detection of rifampin－resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47（7）：2231－2235.

［10］Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al.Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance［J］.N Eng J Med，2010，363（11）：1005－1015.

［11］伊惠霞，侯新月，王泉，等.Xpert MTB/RIF系統(tǒng)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性研究［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（12）：1643－1646.

［12］Nicol MP，Workman L，Isaacs W，et al.Accuracy of the Xpert MTB/RIF test for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children admitted to hospital in Cape Town，South Africa：a descriptive study［J］.Lancet Infect Dis，2011，11（11）：819－824.

［13］Marlowe EM，Novak－Weekley SM，Cumpio J，et al.Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory specimens［J］.J Clin Microbiol，2011，49（4）：1621－1623.

［14］Armand S，Vahuls P，Delcroix G，et al.Comparison of the Xpert MTB/RIF test with an IS6110－TaqMan real－time PCR assay for direct detection of Mycobactenium tuberculosis in respiratory and nonrespiratory specimens ［J］.J Clin Microbiol，2011，49（5）：1772－1776.

［15］張治國(guó)，歐喜超，孫倩，等.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究［J］.中國(guó)防癆雜志，2013，35（1）：13－16.

［16］Lawn SD，Nicol MP.Xpert（R）MTB/RIF assay：development，evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicim resistance［J］.Future Microbiol，2011，6（9）：1067－1082.