魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬的初步研究＊

劉 騰，黃永秀，王 丹，崔涌泉，王建東△，張 紅△

1.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院（成都 610500）；2.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系（成都 610500）；3.中國人民解放軍第37醫(yī)院 檢驗(yàn)病理科（雅安 625000）

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是常見的一種影響中老年運(yùn)動功能的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果［1］顯示，這種疾病主要發(fā)于老年人群，隨著我國人口老齡化速度加快，其發(fā)病率呈現(xiàn)遞增趨勢。已有研究［2－3］認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)線粒體代謝異常是導(dǎo)致PD發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)。有研究［4］表明，細(xì)胞內(nèi)的受損線粒體主要通過自噬途徑降解，因此，自噬途徑的異?？梢宰璧K受損線粒體的降解，從而導(dǎo)致PD發(fā)生。

自噬（autophagy）是細(xì)胞內(nèi)一種依賴溶酶體的物質(zhì)降解途徑，也是細(xì)胞在外界環(huán)境刺激以及生理病理調(diào)控下的自我保護(hù)過程，自噬不足或過度自噬都會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這也是許多疾病的重要致病機(jī)制。自噬主要的研究方法如電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白、細(xì)胞免疫熒光檢測自噬斑等，均已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞自噬的研究［5］。

近年來研究［6－7］發(fā)現(xiàn)，魚藤酮可對機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響，它可選擇性聚集在線粒體等細(xì)胞器，抑制復(fù)合體Ⅰ活性，損害細(xì)胞氧化磷酸化，從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的很多農(nóng)藥含有魚藤酮，從而使人們接觸魚藤酮的機(jī)會大大升高。本研究通過探尋魚藤酮對PC12細(xì)胞自噬的影響，為治療PD提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP－LC3質(zhì)粒的PC12細(xì)胞株為成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。DMEM完全培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司。BCA蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物科技研究所。兔抗LC3B多克隆抗體購自Novus抗體公司，小鼠抗β－actin單克隆抗體購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司。PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自Millipore公司。魚藤酮購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Western blot檢測蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，按照3×105個/孔接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。濃度梯度組：分別加入終濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的魚藤酮處理細(xì)胞，處理12h后收集各組細(xì)胞。時間梯度組：加入終濃度為1μmol/L的魚藤酮，分別處理0、2、6、12、18、24h，收集各組細(xì)胞。在各組細(xì)胞中加入ripa裂解液，冰上裂解細(xì)胞30min，于4℃，14 000 g，離心半徑10cm，離心15min，收集裂解上清液，BCA法測定蛋白濃度。SDS－PAGE電泳，每組上樣60μg/泳道，PVDF膜濕轉(zhuǎn)60～80min，分別加兔抗LC3B抗體（1∶1 000）及小鼠抗β－actin抗體（1∶10 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）或山羊抗小鼠IgG（1∶2 000），37℃，孵育1h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

1.2.2 細(xì)胞熒光技術(shù)檢測細(xì)胞自噬水平 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，接種于放置了多聚賴氨酸包被圓玻片的24孔板中，接種量5×104個/孔，37℃，培養(yǎng)48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。濃度梯度組：分別加入終濃度為 0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的魚藤酮處理細(xì)胞12h。時間梯度組：加入終濃度為1μmol/L的魚藤酮，分別處理0、2、6、12、18、24h。魚藤酮處理完后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，冰甲醇－20℃，固定15min，PBS洗滌3次，封片，利用熒光顯微鏡觀察照相。細(xì)胞自噬水平采用GFP－LC3熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)法，即對每個細(xì)胞中的GFP－LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組樣品隨機(jī)統(tǒng)計(jì)200個細(xì)胞。

1.2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu) 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，按照3×105個/孔接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，加入終濃度為1μmol/L的魚藤酮，分別處理0、2、6、12、18、24h。收集各組細(xì)胞，放于10mL離心管中，800 g，離心半徑14.5cm，離心15min，棄去上清液。沿管壁緩慢加入4mL 0.5%戊二醛固定液，于4℃靜置10～15min，再于10 000 g，離心半徑10.45cm，離心10min，棄去上清液。沿管壁緩慢加入4mL 3%戊二醛固定液進(jìn)行預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定。丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片進(jìn)行光學(xué)定位，超薄切片后進(jìn)行醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，日立H－600型透射電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察各濃度梯度組細(xì)胞中GFPLC3熒光斑點(diǎn)

使用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞中GFP－LC3熒光斑點(diǎn)情況，結(jié)果顯示，隨著魚藤酮濃度升高，PC12細(xì)胞中GFP－LC3熒光斑點(diǎn)的數(shù)量也隨之上升，并且從1μmol/L濃度的魚藤酮處理開始，PC12細(xì)胞的形態(tài)也產(chǎn)生明顯的收縮、變圓等變化（圖1～2）。

2.2 Western blot檢測各濃度梯度組細(xì)胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ表達(dá)

利用Western blot檢測各組細(xì)胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ的表達(dá)情況，結(jié)果表明，隨著魚藤酮濃度的升高，PC12細(xì)胞中LC3－Ⅱ的表達(dá)呈增長趨勢，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，隨著魚藤酮濃度梯度的增加，衡量細(xì)胞自噬水平的LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值也呈梯度增長趨勢（圖3～4）。

圖1 細(xì)胞熒光技術(shù)檢測各組細(xì)胞中GFP－LC3熒光斑點(diǎn)

圖2 各組細(xì)胞中GFP－LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)量（±s）

圖3 Western blot檢測各組細(xì)胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ的表達(dá)

圖4 各組細(xì)胞中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ表達(dá)

2.3 熒光顯微鏡觀察各時間梯度組細(xì)胞中GFPLC3熒光斑點(diǎn)

使用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞中GFP－LC3熒光斑點(diǎn)情況，結(jié)果顯示，隨著魚藤酮處理時間的延長，細(xì)胞中GFP－LC3熒光斑點(diǎn)的數(shù)量也隨之上升，并且魚藤酮處理6h后，PC12細(xì)胞的形態(tài)也產(chǎn)生了收縮、變圓等變化（圖5～6）。

圖5 細(xì)胞熒光技術(shù)檢測各組細(xì)胞中GFP－LC3熒光斑點(diǎn)

圖6 各組細(xì)胞中GFP－LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)量（±s）

2.4 Western blot檢測各時間梯度組細(xì)胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ表達(dá)

利用Western blot檢測各組細(xì)胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ的表達(dá)情況，結(jié)果表明，隨著魚藤酮處理時間的延長，PC12細(xì)胞中LC3－Ⅱ的表達(dá)呈先增高后降低的趨勢，進(jìn)一步的分析結(jié)果顯示，隨著處理時間的增加，衡量細(xì)胞自噬水平的LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值也呈先增高后降低的趨勢（圖7～8）。

圖7 Western blot檢測各組細(xì)胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ的表達(dá)

圖8 各組細(xì)胞中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ表達(dá)

圖9 電鏡觀察1μmol/L魚藤酮處理對PC12細(xì)胞自噬影響（×1 2000）

2.5 透射電鏡觀察各時間梯度組細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)

采用透射電鏡觀察1μmol/L魚藤酮處理PC12細(xì)胞后，細(xì)胞自噬隨時間變化的情況，發(fā)現(xiàn)2h細(xì)胞內(nèi)即可觀察到部分線粒體發(fā)生明顯腫脹；6h和12 h細(xì)胞內(nèi)均有明顯增多的自噬體和自噬溶酶體，并且線粒體數(shù)量明顯減少；18h和24h多數(shù)細(xì)胞均有核濃縮變小，細(xì)胞內(nèi)充滿液泡樣結(jié)構(gòu)，同時多數(shù)細(xì)胞死亡脫落（圖9）。

3 討論

LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值法和LC3熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)是廣泛用于細(xì)胞自噬水平檢測的兩種方法，本研究主要采用這兩種方法研究魚藤酮處理對PC12細(xì)胞自噬水平的影響。結(jié)果顯示，隨著魚藤酮處理濃度的升高，各組細(xì)胞中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值和LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)量均呈上升趨勢，表明魚藤酮處理濃度與細(xì)胞自噬水平有較大的相關(guān)性。同時，魚藤酮處理濃度由0.5μmol/L增加為1μmol/L時，PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，如細(xì)胞突觸明顯減少、多數(shù)細(xì)胞收縮變圓等。已有研究［8－11］證實(shí)，細(xì)胞形態(tài)改變是細(xì)胞發(fā)生大量自噬導(dǎo)致的細(xì)胞主要變化之一，表明1μmol/L魚藤酮處理可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生明顯自噬。因此，選擇1μmol/L魚藤酮處理PC12細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的時間梯度實(shí)驗(yàn)。

在時間梯度實(shí)驗(yàn)中，隨著魚藤酮處理時間延長，PC12細(xì)胞中LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)量也隨之增加，二者表現(xiàn)出較好的一致性。但是，各組細(xì)胞中的LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值，在0～6h處理時間段內(nèi)增高，而在6～24h處理時間段內(nèi)卻降低。已有研究［12－14］表明，在神經(jīng)細(xì)胞中，LC3－Ⅰ的含量明顯高于LC3－Ⅱ，這與LC3－Ⅱ在自噬的發(fā)生過程中很快被清除有關(guān)，并且在自噬的發(fā)生過程中，LC3－Ⅰ會轉(zhuǎn)化成LC3－Ⅱ，因此，可以用LC3－Ⅰ的變化來說明自噬的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，從6h開始細(xì)胞內(nèi)LC3－Ⅰ的含量在逐漸降低，并在24h達(dá)到最低值，表明從6h開始LC3－Ⅰ轉(zhuǎn)化成LC3－Ⅱ的速度增快，使得LC3－Ⅰ的生成速度低于LC3－Ⅰ的轉(zhuǎn)化速度，從另一方面也揭示此時細(xì)胞的自噬水平在增加。

為了進(jìn)一步揭示魚藤酮處理時間對PC12細(xì)胞自噬的影響，本研究采用透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。隨著魚藤酮處理時間延長，PC12細(xì)胞中的線粒體首先發(fā)生腫脹等異常改變，同時細(xì)胞內(nèi)的自噬體和自噬溶酶體也隨之增加，而經(jīng)過長時間（18h后）的處理，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)充滿液泡樣結(jié)構(gòu)，同時細(xì)胞死亡脫落，這一過程類似于細(xì)胞自噬性死亡，但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，魚藤酮處理濃度和處理時間與PC12細(xì)胞的自噬水平存在一定的相關(guān)性，并且1μmol/L魚藤酮處理6h，即可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。而電鏡觀察結(jié)果表明，魚藤酮處理會導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷，從而誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生。

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