膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞分化與自噬的相關(guān)性研究＊

魏子龍，趙耀東，黃 強(qiáng)，任 力△，沙龍貴

1.上海市浦東醫(yī)院 神經(jīng)外科（上海 201300）；2.上海市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)外科（上海 200080）；3.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)外科（蘇州 215004）

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤是由腫瘤中為數(shù)不多的腫瘤干細(xì)胞增殖、發(fā)育所致。膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞（GSPCs）又稱膠質(zhì)瘤始動(dòng)細(xì)胞，在體內(nèi)外均具有無(wú)限增殖能力［1］。神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）能自發(fā)且完全分化為膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元，而GSPCs不能，甚至在誘導(dǎo)分化過程中出現(xiàn)可逆分化［2］。目前，關(guān)于NSCs與GSPCs分化差異及分子機(jī)制的研究多見，而GSPCs分化與自噬關(guān)系的研究少見。自噬是一個(gè)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，通過與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，以此實(shí)現(xiàn)某些細(xì)胞器的更新與細(xì)胞本身的代謝需要［3］。研究［4－5］表明，細(xì)胞分化及發(fā)育與自噬具有一定相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過觀察GSPCs誘導(dǎo)分化前后自噬活性的變化，探討GSPCs分化與自噬的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 GSPCs株由蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科黃強(qiáng)教授實(shí)驗(yàn)室建立，長(zhǎng)期體外傳代并由該實(shí)驗(yàn)室保存。GSPCs取自新鮮膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本（52歲女性患者自愿捐贈(zèng)），經(jīng)分離、體外培養(yǎng)、鑒定及擴(kuò)增保存。

1.1.2 試劑與儀器 1）主要試劑：DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基（體積比1∶1），1/100N2添加劑和20 ng/mL（終濃度）堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，美國(guó)Gibco公司），20ng/mL（終濃度）表皮生長(zhǎng)因子（EGF，美國(guó)Invitrogen公司），微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）抗體（美國(guó) MBL公司），beclin－1抗體（美國(guó)Santa Cruze公司），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、微管相關(guān)蛋白－2（MAP－2）抗體及β－actin抗體（德國(guó)Sigma公司），免疫組織化學(xué)試劑盒［含辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（或羊抗鼠）IgG二抗（1∶2 500）］及DAB顯色試劑盒（上?？婆d生物公司），3－甲基腺嘌呤（3－MA，德國(guó)Sigma公司），BCA 蛋白定量試劑盒（美國(guó)Piece公司），雷帕霉素（RPM，上海齊奧化工科技有限公司）；2）主要實(shí)驗(yàn)儀器：SDSPAGE凝膠電泳儀（美國(guó)Bio－Rad公司），精確度為1μm的Nikon Eclipse TE2000－U型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），精確度為0.1μm 的TCSSP2型共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司），點(diǎn)分辨精確度為0.24nm、線分辨精確度為0.10nm 的JEOL－1230型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

1.2 方法

1.2.1 GSPCs自噬活性檢測(cè) 將GSPCs分為兩組，分別培養(yǎng)于干細(xì)胞培養(yǎng)基和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM/F12）中，隔天更換1次培養(yǎng)基，7d后終止培養(yǎng)。取兩組細(xì)胞用于免疫染色、透射電鏡標(biāo)本制備及Western blot檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 GSPCs誘導(dǎo)分化 GSPCs培養(yǎng)于誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM/F12）中，并分為兩組。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為0.01mmol/L的自噬抑制劑3－MA；對(duì)照組不添加，培養(yǎng)基隔天更換1次，7d后終止培養(yǎng)。隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野至少包含100個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞分化比例根據(jù)倒置相差顯微鏡下細(xì)胞突起伸長(zhǎng)情況進(jìn)行計(jì)算，以（±s，n＝3）表示。同時(shí)行免疫染色，并檢測(cè)GFAP、MAP－2、beclin－1表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 GSPCs未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)分化下自噬激活劑RPM的使用 無(wú)血清條件下培養(yǎng)部分GSPCs，加入不同濃度RPM（0.2μg/mL～12.5ng/mL），24、48h后觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并比較與未加RPM組細(xì)胞形態(tài)的異同；另一部分培養(yǎng)于含3%胎牛血清DMEM/F12的GSPCs，加入0.2μg/mL～12.5 ng/mL不同濃度RPM，24h后觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并與未加RPM組比較細(xì)胞形態(tài)的異同。隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野至少包含100個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞分化比例＝倒置相差顯微鏡下有細(xì)胞突起的細(xì)胞/該視野下的細(xì)胞總數(shù)（包括有突起的細(xì)胞和無(wú)突起的細(xì)胞）×100%，以（±s，n＝3）表示。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)LC3表達(dá) 誘導(dǎo)分化后，將種植于預(yù)鋪多聚賴氨酸玻片上的GSPCs，在分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2h，固定于玻片表面后棄除培養(yǎng)基，PBS沖洗兩次，5min/次；按1∶1比例（甲醇/乙醇）配制固定液，固定20min，PBS沖洗兩次，5min/次，采用0.1%Triton－X100孵育10min后，再用PBS沖洗兩次，5min/次；采用1%BSA封閉液孵育1h，PBS沖洗兩次，5min/次；加入適量一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，5min/次；加入Cy3耦聯(lián)二抗，避光孵育2h，PBS沖洗3次，5min/次；0.5μg/mL DAPI孵育10min后梯度乙醇脫水，自然風(fēng)干，于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) GSPCs均以1mL PBS混勻，以離心半徑5.5cm，轉(zhuǎn)速2 000r/min，離心5min，棄上清，按1∶5比例加入聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）上樣緩沖液混勻，煮沸10min，凝膠電泳；將分離膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維（NC）膜，5%脫脂奶粉封閉1h后滴加一抗，37℃孵育1.5h，TBST緩沖液洗膜3次，5min/次；加入IgG二抗（1∶2 500）室溫孵育1h，TBST緩沖液洗膜3次，5min/次，化學(xué)發(fā)光法顯影。根據(jù)目的基因條帶密度值，半定量計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)豐度。

1.2.6 透射電鏡標(biāo)本制備 采用0.1mol/L戊二醛溶液將待測(cè)GSPCs 4℃固定2h，PBS沖洗，1%鋨酸固定30min后梯度乙醇脫水，醋酸鈾70%丙酮飽和溶液脫水過夜，環(huán)氧樹脂包埋、固化，鉆石刀切割制作組織切片，鎳網(wǎng)收集后，檸檬酸鉛染色8min后觀察自噬小體。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，定量資料比較采用t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 GSPCs自噬活性檢測(cè)結(jié)果

熒光顯微鏡顯示，無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的GSPCs內(nèi)未見熒光強(qiáng)度高的斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（圖1A）。GSPCs在含血清條件下培養(yǎng)7d后貼壁分化，細(xì)胞呈梭形或星形伸出突起樣結(jié)構(gòu)，顯微鏡下可見“突起”近端胞質(zhì)區(qū)有小泡樣結(jié)構(gòu)，免疫染色示相應(yīng)部位LC3呈點(diǎn)樣分布（圖1B）；透射電鏡下可見GSPCs分化細(xì)胞內(nèi)存在典型的自噬小體（圖1C）。Western blot檢測(cè)LC3發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化后GSPCs中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ較分化前顯著增加（圖1D）。

圖1 GSPCs自噬活性檢測(cè)結(jié)果

2.2 3－MA對(duì)GSPCs誘導(dǎo)分化及自噬活性的作用

對(duì)照組貼壁分化為梭形或星形細(xì)胞（圖2A），實(shí)驗(yàn)組貼壁減少（圖2B），定量計(jì)數(shù)表明實(shí)驗(yàn)組分化比例顯著低于對(duì)照組（圖2C）。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組GFAP、MAP－2蛋白表達(dá)量均顯著降低（圖2D和圖2E）。

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組beclin－1表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（圖2F）。免疫細(xì)胞化學(xué)染色示，對(duì)照組胞漿內(nèi)可見較多LC3陽(yáng)性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（圖2G）；實(shí)驗(yàn)組罕見LC3陽(yáng)性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（圖2H）。

圖2 3－MA對(duì)GSPCs誘導(dǎo)分化及自噬活性的作用

2.3 自噬激活劑RPM對(duì)GSPCs分化狀態(tài)的影響

RPM濃度及作用時(shí)間對(duì)無(wú)血清條件下培養(yǎng)的GSPCs形態(tài)學(xué)影響不明顯，而12.5ng/mL RPM能顯著增加含血清條件下培養(yǎng)的GSPCs貼壁分化細(xì)胞（圖3）。

圖3 自噬激活劑RPM對(duì)GSPCs分化狀態(tài)的影響

3 討論

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力主要來源于腫瘤細(xì)胞中的一些細(xì)胞，即癌干細(xì)胞（CSCs）。目前，CSCs已在多種腫瘤組織中被證實(shí)。本研究亦從1例膠質(zhì)瘤組織中成功獲得GSPCs。一般而言，CSCs只能分化為具有親本表型的癌細(xì)胞，而GSPCs只能分化為不成熟的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。由于GSPCs具有自我更新及不能成熟分化的特征，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及對(duì)放化療的阻抗［6］。研究已表明，自噬在多種細(xì)胞分化中具有重要作用［7－8］。LC3是自噬小體的特異性標(biāo)志分子［9］，以LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ兩種分子存在，且兩者比例與自噬小體數(shù)量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的GSPCs，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)示LC3呈陰性，表明其自噬活性低。GSPCs在含血清條件下培養(yǎng)7d后貼壁分化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色示LC3呈點(diǎn)樣分布；透射電鏡下可見GSPCs分化細(xì)胞內(nèi)存在典型自噬小體；Western blot檢測(cè)LC3發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化后GSPCs中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ較分化前顯著增加，表明GSPCs自噬活性顯著增加，提示GSPCs在未分化狀態(tài)下自噬活性低，誘導(dǎo)分化后自噬活性顯著增加。

GFAP和 MAP－2表達(dá)量越高，說明細(xì)胞分化越成熟。beclin－1是自噬所必須的抑癌基因［10］，其表達(dá)量降低提示自噬活性低下。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞貼壁減少，分化比例降低；免疫細(xì)胞化學(xué)染色示胞漿內(nèi)罕見LC3陽(yáng)性表達(dá)；Western blot檢測(cè)證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組GFAP、MAP－2及beclin－1表達(dá)量均顯著降低，表明GSPCs誘導(dǎo)分化時(shí)，加入自噬抑制劑3－MA能抑制GSPCs誘導(dǎo)分化過程中原本增強(qiáng)的自噬活性，從而抑制GSPCs分化，提示自噬活性低可抑制GSPCs分化。此外，本實(shí)驗(yàn)還利用自噬激活劑RPM在無(wú)血清條件下作用于GSPCs，結(jié)果顯示RPM濃度及作用時(shí)間對(duì)無(wú)血清條件下培養(yǎng)的GSPCs形態(tài)學(xué)無(wú)顯著影響，與Zeng等［11］研究結(jié)果一致。GSPCs在含血清條件下培養(yǎng)時(shí)，適當(dāng)濃度的RPM可促進(jìn)其貼壁分化。為防止高濃度血清（10%）明顯誘導(dǎo)GSPCs的分化，本實(shí)驗(yàn)將GSPCs培養(yǎng)于含3%胎牛血清的培養(yǎng)液中，24h后發(fā)現(xiàn)，在含3%胎牛血清條件下，無(wú)論是否有RPM，GSPCs均可貼壁分化，但RPM 存在時(shí)，GSPCs分化更明顯，說明增強(qiáng)GSPCs自噬活性可提高其分化比例。

綜上所述，GSPCs分化與其自噬活性密切相關(guān)。誘導(dǎo)分化后，GSPCs自噬活性增高，增強(qiáng)GSPCs自噬活性可促進(jìn)分化，抑制其自噬活性可抑制分化，與Nabissi等［12］研究結(jié)果一致。

本研究提示，至少在部分腫瘤干細(xì)胞中自噬活性低下是其分化抑制的一種原因，這為抗腫瘤治療提供了一種思路，在應(yīng)用放化療手段的同時(shí)可加用自噬活劑，通過增強(qiáng)其自噬活性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，減輕其惡性程度及對(duì)放化療的阻抗，從而提高腫瘤治療的療效。

［1］Wang Z，F(xiàn)ei X，Dai X，et al.Differentiation of glioma stem cells and progenitor cells into local host cell－like cells：a study based on choroidcarcinoma differentiation of choroid plexus of GFP transgenic nude mouse［J］.Cancer Biother Radiopharm，2015，30（5）：225－232.

［2］Yamamuro S，Okamoto Y，Sano E，et al.Characterization of glioma stem－like cells from human glioblastomas［J］.Int J Oncol，2015，47（1）：91－96.

［3］Calabrese C，Poppleton H，Kocak M，et al.A perivascular niche for brain tumor stem cells［J］.Cancer Cell，2007，11（1）：69－82.

［4］Yuan J，Yu M，Li HH，et al.Autophagy contributes to IL－17－induced plasma cell differentiation in experimental autoimmune myocarditis［J］.Int Immunopharmacol，2014，18（1）：98－105.

［5］Orfali N，O′Donovan TR，Nyhan MJ，et al.Induction of autophagy is a key component of all－trans－retinoic acidinduced differentiation in leukemia cells and a potential target for pharmacologic modulation［J］.Exp Hematol，2015，43（9）：781－793.

［6］龔海東，張哲男，胡永珍，等.miR－155與膠質(zhì)瘤的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（35）：6994－6997.

［7］蔣卉男，胡榮，劉卓剛，等.自噬與白血病治療研究最新進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015，23（1）：290－294.

［8］朱朋飛，秦建民.細(xì)胞自噬在原發(fā)性肝癌發(fā)生與防治中的生物學(xué)作用［J］.中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2015，5（4）：24－28.

［9］Kanzawa T，Germano IM，Komata T，et al.Role of autophagy in temozolomide－induced cytotoxicity for malignant glioma cells［J］.Cell Death Differ，2004，11（4）：448－457.

［10］Wang RC，Wei Y，An Z，et al.Akt－mediated regulation of autophagy and tumorigenesis through beclin 1 phosphorylation［J］.Science，2012，338（6109）：956－959.

［11］Zeng M，Zhou JN.Roles of autophagy and mTOR signaling in neuronal differentiation of mouse neuroblastoma cells［J］.Cell Signal，2008，20（4）：659－665.

［12］Nabissi M，Morelli MB，Amantini C，et al.Cannabidiol stimulates Aml－1a－dependent glial differentiation and inhibits glioma stem－like cells proliferation by inducing autophagy in a TRPV2－dependent manner［J］.Int J Cancer，2015，137（8）：1855－1869.