雞新城疫病原學(xué)及疫苗研究進展

文│崔健（山東省臨朐縣檢驗檢測中心）

雞新城疫病原學(xué)及疫苗研究進展

文│崔健（山東省臨朐縣檢驗檢測中心）

雞新城疫（Newcastle Disease，ND）又稱為亞洲雞瘟、偽雞瘟，我國俗稱雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一種主要侵害雞和火雞的急性、高度接觸性和高度毀滅性的禽類烈性傳染病。強毒感染易感禽在臨床上常呈敗血性經(jīng)過，主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)機能紊亂、黏膜和漿膜出血。本病發(fā)病急、致死率高，經(jīng)常給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。

ND于1926年首次發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞的爪哇島，同年發(fā)現(xiàn)于英國紐卡斯?fàn)柺校∟ewcastle），1927年Doyle首次分離到病原，根據(jù)發(fā)現(xiàn)地名命名為新城疫，經(jīng)過30多年時間傳播到世界各地。我國于1928年有類似本病的記錄，1935年發(fā)生地方性流行。1946年，梁英和馬聞天第一次報道在1935年發(fā)病的病料中分離到新城疫病毒，從而確認(rèn)本病在我國的存在。

ND傳播迅速，死亡率高，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。最近幾年除雞發(fā)生本病外，過去很少出現(xiàn)臨床癥狀的鴨、鵝等水禽和其他經(jīng)濟禽類以及鳥類發(fā)生新城疫的報道也逐年增加，并引起了國內(nèi)外專家學(xué)者的重視和不斷深入研究。本文著重對新城疫的病原學(xué)、毒力演化以及疫苗研究近況等方面進行綜述。

一、病原學(xué)

1.NDV的一般生物學(xué)特性。

NDV為副粘病毒科腮腺炎病毒屬。NDV完整病毒粒子近圓形，直徑為10～250納米。但常因囊膜破損而形態(tài)不規(guī)則，也常見橫斷直徑為100納米左右的不同長度的細絲。有囊膜，在囊膜的外層有呈放射狀排列的纖突，能刺激宿主產(chǎn)生抑制病毒凝集紅細胞的抗體和病毒中和抗體。

病毒核酸類型為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA，基因組是由15186或15192個核苷酸構(gòu)成，在NDV基因組上依次排列著NP、P、M、F、HN和L基因，分別編碼核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L）。

盡管病毒在宿主體外生存受環(huán)境溫度、濕度、陽光和病毒數(shù)量、毒株種類、貯存條件及是否存在有機物等多種因素的影響，總體而言NDV對理化因素的抵抗力比較強。NDV在pH3～10時不被破壞，真空凍干病毒30℃可存活30天，在4℃幾周、-20℃幾個月、-70℃幾年后仍能保持感染力。但NDV對消毒劑、高溫及紫外線較敏感，在直射陽光下經(jīng)30分鐘即可死亡。一般消毒劑常用濃度殺毒效果良好，如5%漂白粉、1%氫氧化鈉、70%酒精20分鐘即可將NDV殺死。

2.NDV的生物學(xué)活性。

（1）血凝活性（HA）。NDV的血凝活性是由于其囊膜表面的HN糖蛋白與紅細胞的表面受體結(jié)合所引起的。NDV可凝集所有兩棲類、爬行類、禽類及小鼠、豚鼠的紅細胞，但凝集牛、綿羊、山羊、豬、馬及人O型血紅細胞的能力則隨毒株的不同而有變化。利用這一特性，用雞的紅細胞做HA試驗，并結(jié)合抗血清的特異性抑制作用（即HI試驗）可診斷ND的發(fā)生和監(jiān)測免疫狀況。

（2）神經(jīng)氨酸酶活性（NA）。神經(jīng)氨酸酶（黏多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸水解酶）是HN蛋白的一部分，該酶的作用是可將病毒逐漸從紅細胞上洗脫下來，還可作用于受體位點，使F蛋白充分接近細胞而發(fā)生病毒與細胞的膜融合。

（3）細胞融合與溶血活性。NDV可引起紅細胞溶解或與其他細胞融合。病毒復(fù)制時附著于受體位點，隨后引起病毒囊膜與細胞膜的融合，進而導(dǎo)致兩個或多個細胞的融合，該活性也可被特異性抗血清抑制。

（4）其他活性。最近的研究發(fā)現(xiàn)，NDV除了有誘導(dǎo)干擾素生成的作用，還有抗腫瘤免疫、引起細胞凋亡的作用。研究顯示，NDV能選擇性地殺傷腫瘤細胞，而對人的成纖維細胞沒有殺傷作用。許多人類的腫瘤細胞都能高效地被NDV感染，并通過腫瘤細胞增殖進行自我復(fù)制，這種增殖與復(fù)制無傳染性。Schinmmacher等發(fā)現(xiàn)NDV有促進巨噬細胞抗腫瘤活動的能力，誘導(dǎo)出現(xiàn)抗腫瘤白細胞聚集和抗腫瘤細胞毒作用以及誘導(dǎo)腫瘤壞死因子（TNF）的表達，還可抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和生長。

3.NDV的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能。

研究表明，HN、F兩種糖蛋白是構(gòu)成NDV致病性的分子基礎(chǔ)。F蛋白分子量為59千道爾頓，由553個氨基酸組成，以羧基端嵌合在病毒囊膜上，具有使病毒囊膜與宿主細胞膜融合、導(dǎo)致病毒進入細胞和溶血的作用。

HN糖蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，在病毒侵染過程中的作用是識別細胞受體、介導(dǎo)病毒吸附于靶細胞膜上的唾液酸受體而啟動感染過程以及在病毒復(fù)制周期中加強病毒顆粒的移動和促進從感染細胞中釋放。

4.NDV的基因型、致病型和抗原型。NDV只有一個血清型，使用傳統(tǒng)的試驗手段對NDV不同毒株的差異性分析只能采用毒力、蝕斑形成能力測定或單克隆抗體技術(shù)等試驗來進行，但如此分型存在一些局限性，使得NDV流行病學(xué)研究一直難以突破。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，Ballagi等最早在分子水平上對不同的NDV毒株進行差異性分析，從而進行基因分型的方法。

方法一是應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴增NDVF基因全長75%的片段（即334-1682nt位核苷酸片段），通過對擴增片段的核酸序列分析和3種限制性內(nèi)切酶（HinfI、Bst0I、Rsal）的酶切位點的分布情況分析，將NDV毒株進行基因分型。

方法二是應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增NDVF基因高變區(qū)，即47-420nt（ORF的1-374nt）位基因片段，對該片段進行核酸序列測定，然后繪制遺傳進化樹，確定NDV的分型。遺傳進化樹分析和酶切圖譜分析反映的NDV毒株之間的遺傳關(guān)系相當(dāng)一致。

依據(jù)這種方法，目前可以將NDV分為10個基因型，NDV也顯現(xiàn)出一定的遺傳演化規(guī)律，新城疫的每一次大流行都會有新的基因型出現(xiàn)，并且以新基因型為主。

二、NDV的演化與遺傳進化

1.世界ND的流行。綜合近十年來的研究發(fā)現(xiàn)，NDV并沒有出現(xiàn)超強毒株，但是在強大的疫苗免疫壓力和用藥環(huán)境之下，NDV毒株呈現(xiàn)出毒力逐漸增強而引發(fā)疾病的現(xiàn)象，尤其是近年來導(dǎo)致水禽發(fā)病。綜合國內(nèi)外有關(guān)NDV毒力的變化和新城疫在全球的發(fā)生，共有過3次大流行。

第一次是于1926年起源于東南亞，經(jīng)亞洲向歐洲的緩慢傳播，經(jīng)30年傳播到世界各地。研究證實，20世紀(jì)30至50年代世界上ND的大流行主要由基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型NDV引起。第二次大流行于20世紀(jì)60年代末，起始于中東，至1973年就已波及大多數(shù)國家。這次大流行之所以傳播如此迅速，是由于家禽飼養(yǎng)方式的變革及大規(guī)模國際貿(mào)易造成的。此次大流行主要由基因Ⅳ和Ⅴ型所致。第三次大流行的暴發(fā)于70年代末起源于中東，發(fā)病雞主要為神經(jīng)型，無呼吸道癥狀，1981年到達歐洲后迅速蔓延到世界各地，主要由基因Ⅴ、Ⅵ型引起。

20世紀(jì)90年代以來，雖然沒有出現(xiàn)世界性的大流行，但局部地區(qū)的流行和爆發(fā)時常發(fā)生，此時期的NDV主要以基因Ⅶ型為主。而且此時新城疫的發(fā)生均出現(xiàn)在免疫雞群中，死亡率不是很高，但由于造成生產(chǎn)性能的降低，所造成的損失仍然十分嚴(yán)重。

2.我國ND的流行特點。進入20世紀(jì)80年代中后期，我國ND的流行呈現(xiàn)出了一些新的特點：

（1）非典型ND已經(jīng)成為ND流行的主要形式。往往發(fā)生于免疫雞群；發(fā)病時間主要集中在免疫前后，同時也有相當(dāng)數(shù)量的雞群發(fā)病日齡提前，甚至10日齡以前就有雞只發(fā)?。涣餍械姆绞揭缘胤叫陨l(fā)或小規(guī)模流行為主，多發(fā)于冬春兩季；病雞的臨床表現(xiàn)和病理變化差異很大，多不具有典型的消化道癥狀。病程較長，發(fā)病率高低不等，死亡率不高，但對雞群的生產(chǎn)性能影響較大。

（2）鴨、鵝等水禽中出現(xiàn)了致病性強的NDV。以往認(rèn)為水禽和其他禽類抵抗力甚強，即使強毒株感染水禽也不表現(xiàn)癥狀。然而，近年在我國水禽飼養(yǎng)密集地區(qū)，由NDV引起鴨的發(fā)病及鵝的死亡越來越普遍。這可能表明，出現(xiàn)了對水禽特別是鵝呈高致病力的致病型。研究表明它屬于基因Ⅶ型，對雞亦是高致病性的，而且在抗原性上顯示出與經(jīng)典的NDV存在明顯差異。

近十年來，我國學(xué)者對國內(nèi)NDV的分子流行病學(xué)進行了大量調(diào)查研究，綜合這些文獻發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)90年代以來我國新城疫的流行情況與世界的流行趨勢相符，但同時又有自身的特點，雖然主要以基因Ⅶ型為主，但其他老基因型也一直存在?；颌鱠型和基因Ⅶe型是我國近年來的優(yōu)勢流行株，而基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型在我國不同的地區(qū)仍然存在，這些老基因型的存在增加了我國對NDV研究的復(fù)雜性。

在流行毒株方面同樣也是有著明顯規(guī)律，除了第三次大流行中的基因Ⅵ型以外，基因Ⅶ型是遍及全世界的流行毒株，是分布和出現(xiàn)幾率最高的基因型。而在中國除了這兩種基因型以外，還有一種與基因Ⅲ型關(guān)系較近的、我國特有的基因Ⅸ型的流行。

三、ND疫苗

目前，ND疫苗的種類較多，不同種類的疫苗免疫性能、免疫方法不同，主要有活苗、滅活苗和基因工程疫苗。

1.活苗。目前我國常用的活疫苗有兩大類：中等毒力的I系和弱毒的Ⅱ系、Ⅲ系和Ⅳ系。

中等毒力Ⅰ系疫苗，如Mukteswar株（Ⅰ系）、Roakin株、Komorov株和Hertfordshire株（Herts33）等，免疫原性強，中等毒力，只適用于1月齡以上的雞，對幼雛有一定的致病性，產(chǎn)生的免疫力持久。

Ⅱ系苗，可用于首免和加強免疫，接種方法可噴霧、點眼、滴鼻、飲水和注射，目前多用于種雞首免。

Ⅲ系（也稱F系）苗，毒力介于Ⅱ系和Ⅳ系之間，可用于7日齡以上雞的免疫，目前應(yīng)用較少。

Ⅳ系苗的毒力和免疫原性都比Ⅱ系稍強，代表株為LaSota株，適用于任何日齡的雞，也是目前應(yīng)用最多的弱毒疫苗毒株。一般用于7日齡以上雞的首免和加強免疫。

另外，隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)和單克隆技術(shù)的發(fā)展，細胞苗和克隆苗也越來越多地被應(yīng)用。如Clone-30弱毒苗、單克隆N-79型LaSota弱毒株、克隆-83等，其特點是毒力低、免疫源性好，可用于具有較高母源抗體的雛雞。

活疫苗成本低廉，操作方便，能快速產(chǎn)生局部免疫，便于大群免疫，能同時刺激產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，免疫效果好，因此在世界許多國家被廣泛用來防治新城疫。

但是弱毒疫苗和中等毒力疫苗可在雞呼吸道復(fù)制，引起溫和的病變，其也存在毒力可能返強、散毒風(fēng)險，中等毒力毒株也可能對免疫雞引起接種反應(yīng)，安全性受到質(zhì)疑。

2.滅活疫苗。滅活疫苗不存在安全性問題，可引起堅強而持久的免疫力。常用的滅活疫苗是油佐劑滅活苗，最常用于蛋雞和種雞，但是因為其產(chǎn)生免疫力的時間較長，雛雞使用時應(yīng)配合弱毒活疫苗同時使用。

滅活疫苗是用物理或化學(xué)方法滅活病毒獲得疫苗抗原，并用佐劑乳化成的疫苗。因使用已滅活的抗原，所以安全性好。目前新城疫白油佐劑滅活疫苗應(yīng)用較為廣泛，直到目前仍然被當(dāng)作重要的免疫預(yù)防疫苗。無論滅活疫苗還是活疫苗免疫預(yù)防新城疫，必須制定合理的免疫程序，才能發(fā)揮疫苗最大效力保證抵抗病毒攻擊。

3.基因工程疫苗。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)上的發(fā)展，體外重組DNA技術(shù)使得NDV基因工程疫苗的研制成為研究熱點。從80年代末至今，已有多種NDV毒株的糖蛋白F和（或）HN基因在多種病毒載體上得到表達，制備出重組活載體疫苗或亞單位疫苗。

桿狀病毒載體系統(tǒng)是研制NDV亞單位苗的主要工具。迄今為止，已有NDV B1株、Hitchner株、Miyadera株、D26株的HN和F基因在桿狀病毒系統(tǒng)中表達。用感染重組桿狀病毒的家蠶或組織細胞加工制備成的油佐劑疫苗免疫試驗雞，能抵抗強毒的攻擊。

在重組雞痘病毒載體中，不論是單獨表達F或HN糖蛋白之一，還是共同表達F和HN糖蛋白，都能使被其免疫的無特定病原體（SPF）雞產(chǎn)生對NDV強毒攻擊的保護作用，這種保護力至少維持8周。Taylor等發(fā)現(xiàn)，表達F的重組雞痘病毒肌肉或皮下接種優(yōu)于口服或滴鼻免疫，產(chǎn)生抗體的過程快而且水平高，能夠產(chǎn)生完全保護。

美國農(nóng)業(yè)部于1995年正式批準(zhǔn)了第一個重組雞痘病毒活載體疫苗-VectorVAXFP-N的商品化，該重組活疫苗免疫效果與常規(guī)ND疫苗相當(dāng)，并且一次免疫即可保護雞抵抗NDV強毒的攻擊。同時，Wolff、Scanlon、Gorman、Hodder及我國學(xué)者陳洪巖等在基因疫苗、抗獨特型抗體疫苗的研制方面都曾進行了有益探索，并取得了一定的進展。

由于傳統(tǒng)疫苗在安全性、穩(wěn)定性及免疫原性等方面存在一些不足，許多學(xué)者都致力于研制更為安全有效的疫苗。基因工程疫苗具有毒性低、免疫源性好、生產(chǎn)成本低、利于大批量生產(chǎn)、易于區(qū)分自然感染與免疫感染及便于診斷的優(yōu)點，是今后ND疫苗發(fā)展的方向。